史利歡，陳 靜，謝 昕，劉 煒

(河南省兒童醫(yī)院·鄭州兒童醫(yī)院，河南省小兒血液醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一種多發(fā)于兒童的皰疹病毒科γ亞科DNA病毒，主要通過(guò)感染人B淋巴細(xì)胞，引起免疫功能紊亂而發(fā)病，還可以長(zhǎng)期潛伏在體內(nèi)，通過(guò)影響多種潛伏基因表達(dá)，引起全身各系統(tǒng)和器官疾病[1]。研究顯示，兒童EBV感染可以誘發(fā)嚴(yán)重的免疫功能紊亂，引起一系列的免疫病理?yè)p傷，包括傳染性單核細(xì)胞增多癥(infectious mononucleosis，IM)[2]、EBV相關(guān)噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥(EBV-associatedhemophagocyticlymphohistiocytosis，EBV-HLH)[3]、慢性活動(dòng)性EBV感染(Chronic active EBV，CAEBV)[4]等，少部分甚至可發(fā)展為惡性腫瘤。IM是EBV感染引起的一種良性免疫病理性疾病，大部分患者均預(yù)后良好，而EBV-HLH和CAEBV病情相對(duì)較為嚴(yán)重，預(yù)后相對(duì)較差，甚至可以危及患者生命[5，6]。目前有關(guān)IM、EBV-HLH及CAEBV等EBV感染相關(guān)非腫瘤性疾病的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，分析疾病發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制，指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。EBV 潛伏膜蛋白(latent membrane protein 1，LMP1)是EBV潛伏感染主要的基因表達(dá)產(chǎn)物，不僅可以參與EBV感染相關(guān)腫瘤的發(fā)生，還可以影響機(jī)體的免疫功能，參與IM、EBV-HLH等多種EBV感染相關(guān)非腫瘤性疾病的發(fā)生[7]。既往研究分析了LMP1基因變異與兒童EB病毒感染相關(guān)腫瘤性疾病的關(guān)系[8]，但LMP1基因多態(tài)性與兒童EBV感染相關(guān)非腫瘤性疾病之間的關(guān)系尚不清楚。本研究檢測(cè)了兒童EBV感染相關(guān)非腫瘤性疾病的LMP1基因多態(tài)性，并分析了其基因多態(tài)性與疾病發(fā)生和進(jìn)展之間的關(guān)系，旨在為EBV感染患兒的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年12月至2020年12月在鄭州兒童醫(yī)院確診的94例EBV感染相關(guān)非腫瘤性疾病患兒，納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合2016年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《兒童主要非腫瘤性EB病毒感染相關(guān)疾病的診斷和治療原則建議》中EBV感染相關(guān)非腫瘤性疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，所有患兒均在癥狀發(fā)作48 h內(nèi)入院檢查；EBV抗體檢測(cè)均為陽(yáng)性，且均獲得了患兒家屬的知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：EB病毒感染相關(guān)腫瘤性疾??；存在貧血、出血及其它血液系統(tǒng)疾病者；存在自身免疫性疾病和惡性腫瘤等者。94例EBV患兒中男63例，女31例，年齡1～12歲[(6.08±2.03)歲]，其中IM患兒40例，EBV-HLH患兒30例，CAEBV患兒24例。隨機(jī)選取同期攜帶EBV病毒的無(wú)癥狀兒童94例為對(duì)照組，所有患兒均在健康體檢時(shí)經(jīng)血常規(guī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)中性細(xì)胞降低，淋巴細(xì)胞偏高，并經(jīng)EBV抗體檢測(cè)為陽(yáng)性，同時(shí)排除存在既往EBV感染癥狀患兒。男61例，女33例，年齡1～12歲[(5.83±1.93)歲]。兩組患兒的年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)鄭州兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 方法①臨床癥狀：記錄EBV感染相關(guān)非腫瘤性疾病患兒入院時(shí)的臨床癥狀。②免疫球蛋白水平檢測(cè)：入院第2 d，采集患兒空腹血液2 ml，離心(3000 rpm，10 min)，取血清，采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、IgA、IgM、IgE、補(bǔ)體3(complement，C3)和C4水平。③外周血淋巴細(xì)胞EBV病毒載量和LMP1表達(dá)水平：入院第2 d，采集所有EBV感染患兒的靜脈血2 ml，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，提取PBMC細(xì)胞的DNA，采用EBV檢測(cè)試劑盒(上海谷研實(shí)業(yè)有限公司)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)EBV DNA載量，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。入組第2 d，采用RT-PCR檢測(cè)LMP1 mRNA水平，上游引物：5’-CTAGGAAGAAGGCCAAAA-3’，下游引物：5’-AACGCAGTCTTAGGTATC-3’。Western blot方法檢測(cè)PBMC中LMP1蛋白表達(dá)水平。④EBV患兒LMP1基因多態(tài)性檢測(cè)：入組第2 d，參考已有文獻(xiàn)[10]，采用巢式PCR擴(kuò)增LMP1基因，引物序列見表1，采用末端終止法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，以EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8序列作為參比進(jìn)行分析。

表1 LMP1基因擴(kuò)增和測(cè)序引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0軟件分析所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。滿足正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較多組間差異性，SNK-q比較多組兩兩組間的差異；計(jì)數(shù)資料采用例(率)表示，采用χ2檢驗(yàn)分析比較；采用Pearson相關(guān)性分析LMP1基因多態(tài)性與EBV DNA載量、LMP1表達(dá)和免疫球蛋白水平變化之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的臨床表現(xiàn)EBV-HLH組患兒脾腫大和肝腫大的發(fā)生率明顯高于IM組，咽峽炎、淋巴結(jié)腫大和眼瞼水腫的發(fā)生率明顯低于IM組(P<0.05)；CAEBV組脾腫大和肝腫大的發(fā)生率明顯高于IM組，咽峽炎和眼瞼水腫的發(fā)生率明顯低于IM組，淋巴結(jié)腫大的發(fā)生率明顯高于EBV-HLH組(P<0.05)。見表2。

表2 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的臨床表現(xiàn)比較 [n(%)]

2.2 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的血清免疫球蛋白水平變化各組患兒免疫球蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的血清免疫球蛋白水平變化 (g/L)

2.3 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的血LMP1表達(dá)水平各組患兒EBV-DNA載量和LMP1表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的血LMP1表達(dá)水平

2.4 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的LMP1基因變異類型EBV-HLH組患兒LMP1基因XhoⅠ位點(diǎn)(-)和del-LMP1的發(fā)生率明顯高于IM組和對(duì)照組(P<0.05)；CAEBV組LMP1基因XhoⅠ位點(diǎn)(-)和del-LMP1的發(fā)生率與EBV-HLH組、IM組和對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的LMP1基因變異類型 [n(%)]

2.5 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的LMP1基因變異與EBV-DNA病毒載量之間的關(guān)系采用變量賦值，XhoⅠ位點(diǎn)(+)=0，XhoⅠ位點(diǎn)(-)=1；wt-LMP1=0，del-LMP1=1。EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒LMP1基因XhoⅠ位點(diǎn)(-)變異和del-LMP1位點(diǎn)變異與EBV-DNA、LMP1蛋白和LMP1 mRNA 呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見表6。

表6 EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒的LMP1基因變異與EBV-DNA病毒載量之間的關(guān)系

3 討論

EBV是兒科臨床常見的一種雙鏈DNA病毒感染性疾病，主要通過(guò)感染人B淋巴細(xì)胞，引起一系列的免疫病理?yè)p傷[11]。既往已有多項(xiàng)研究分析了EBV感染相關(guān)腫瘤性疾病的臨床特征和LMP1基因變異情況，但對(duì)EBV感染相關(guān)非腫瘤性疾病的關(guān)注較少[12，13]。本研究分析了幾種常見EBV感染相關(guān)非腫瘤性疾病IM、EBV-HLH和CAEBV的臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)EBV-HLH和CAEBV患兒肝脾腫大的發(fā)生率高于IM患兒，咽峽炎、淋巴結(jié)腫大和眼瞼水腫的發(fā)生率低于IM患兒。研究顯示[14]，IM 患兒最常見的臨床表現(xiàn)是發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結(jié)腫大等，CAEBV患兒臨床主要表現(xiàn)為慢性的或反復(fù)出現(xiàn)的IM樣癥狀，隨病情發(fā)展可導(dǎo)致HLH，引起多組織器官功能損傷，危及患兒生命[15]。結(jié)合本研究結(jié)果表明，隨著IM病情進(jìn)展，疾病可發(fā)展為CAEBV，甚至EBV-HLH，臨床癥狀逐漸加重，提示臨床可根據(jù)EBV感染患兒的臨床表現(xiàn)和癥狀嚴(yán)重程度，評(píng)估疾病進(jìn)展，指導(dǎo)臨床治療。本研究中，隨著IM向CAEBV 和EBV-HLH組進(jìn)展，血清IgG、IgA、C3和C4水平明顯降低。已有多項(xiàng)研究顯示，EBV感染可引起患者免疫功能下降，其中IM 組患兒血清免疫球蛋白水平變化不明顯，EBV-HLH 患兒免疫球蛋白水平出現(xiàn)明顯下降[16，17]，本研究結(jié)果與其基本類似，提示隨著病情進(jìn)展，機(jī)體免疫功能下降。

本研究中，隨著IM向CAEBV 和EBV-HLH組進(jìn)展，患兒EBV-DNA載量和LMP1表達(dá)水平明顯升高。LMP1基因是公認(rèn)的EBV致癌基因，近年來(lái)研究顯示，LMP1可以通過(guò)誘導(dǎo)核因子κB信號(hào)通路活化，調(diào)節(jié)多種免疫炎癥介質(zhì)釋放，參與IM的疾病進(jìn)展[18]，提示LMP1與EBV感染的病情進(jìn)展有關(guān)，臨床可根據(jù)患兒血清LMP1水平，評(píng)估疾病進(jìn)展，指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療方案的進(jìn)行。本研究中，EBV-HLH組患兒LMP1基因XhoⅠ位點(diǎn)(-)和Del-LMP1的發(fā)生率明顯高于IM組和對(duì)照組，說(shuō)明LMP1基因多態(tài)性與EBV感染進(jìn)展有關(guān)。LMP1基因位于在EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8中的nt169474-168193 之間，編碼含 386 個(gè)氨基酸(amino acid，aa)的跨膜蛋白LMP1。XhoI(-)變異是指LMP1 基因N 端第 17 位氨基酸出現(xiàn)核苷酸t(yī)→g突變，導(dǎo)致XhoI酶切位點(diǎn)丟失，del-LMP1變異是指C端胞漿區(qū)(aa187～386)出現(xiàn)30 bp缺失(aa343-352 GGGHSHDSGH)[19]。Wang等[20]研究顯示，XhoI(-)和del-LMP1變異與EBV感染相關(guān)淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)。本研究中，EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒LMP1基因XhoⅠ位點(diǎn)(-)變異和del-LMP1位點(diǎn)變異與EBV-DNA、LMP1蛋白和LMP1 mRNA 呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明XhoI(-)和del-LMP1變異可能通過(guò)影響EBV感染相關(guān)蛋白LMP1表達(dá)，推進(jìn)疾病進(jìn)展。

綜上所述，EBV-HLH患兒的免疫功能明顯低于CAEBV患兒，低于IM患兒，EBV-DNA載量和LMP1表達(dá)水平明顯高于CAEBV患兒，高于IM患兒，且EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒LMP1基因XhoⅠ位點(diǎn)(-)變異和del-LMP1位點(diǎn)變異與EBV-DNA、LMP1蛋白和LMP1 mRNA 呈顯著正相關(guān)關(guān)系，臨床可根據(jù)EBV患兒LMP1基因多態(tài)性和血清中水平變化，指導(dǎo)臨床治療工作的進(jìn)行。

本研究不足之處在于樣本數(shù)量較少，且本研究主要探討了EBV感染相關(guān)非腫瘤疾病患兒LMP1基因多態(tài)性變化，但基因多態(tài)性影響EBV感染進(jìn)展的具體機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究探索。