范瀟月，劉飛飛，陳琳琳

(四川省德陽市人民醫(yī)院，四川 德陽 618000)

細(xì)菌感染是肝硬化患者嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是重癥肝病患者重要的致死原因之一，細(xì)菌感染的發(fā)生會促進(jìn)肝硬化患者疾病進(jìn)展，誘發(fā)失代償、膿毒血癥、肝衰竭等，增加患者死亡風(fēng)險[1]。因此，及時診斷感染的存在，對于肝硬化患者的臨床治療以及預(yù)后意義重大。肝硬化患者感染早期，因病原體“扳機(jī)”效應(yīng)，繼發(fā)肝硬化免疫損傷，導(dǎo)致細(xì)胞大量壞死，釋放降鈣素原(PCT)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子，而上述促炎因子進(jìn)一步通過“瀑布效應(yīng)”誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，致使機(jī)體呈免疫抑制狀態(tài)，進(jìn)一步增加繼發(fā)感染機(jī)會[2]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)外周血免疫球蛋白、補(bǔ)體水平與患者的感染有關(guān)[3]。Toll樣受體(TLR)是近年來發(fā)現(xiàn)的在宿主免疫應(yīng)答中起重要作用的細(xì)胞表面受體分子，其中TLR-2是目前了解較多的受體，且與免疫功能關(guān)系最為密切[4]。CD14是單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的特征性標(biāo)記，與細(xì)菌感染關(guān)系密切[5]。目前國內(nèi)關(guān)于外周血循環(huán)因子與肝硬化并發(fā)感染的研究報道并不多見，之間的相關(guān)性仍不清楚。本研究通過分析檢測外周血CD14、TLR2的表達(dá)以及PCT、TNF-α水平的變化，旨在分析其免疫指標(biāo)與感染及其預(yù)后的相關(guān)性，進(jìn)一步明確外周血CD14+單核細(xì)胞TLR2表達(dá)的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年8月至2020年10月我院診治的104例肝硬化患者為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)患者病史、臨床表現(xiàn)、實驗室以及影像學(xué)檢查確診為肝硬化，并符合肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤、心肺腎功能障礙、肝移植患者。選擇同期我院健康體檢者96例為對照組。研究組男77例，女27例；年齡32～69歲[(51.05±9.62)歲]。對照組男71例，女25例；年齡30～70歲[(52.09±8.85)歲]。根據(jù)患者是否發(fā)生感染將研究組分為感染組45例和未感染組59例，感染組男34例，女11例；年齡32～65歲[(51.34±9.43)歲]；肝硬化類型：乙型肝炎21例，丙型肝炎4例，酒精性18例，原因不明型2例；肝功能分級(Child-Pugh分級法)：A級25例，B級14例，C級6例。未感染組男43例，女16例；年齡33～69歲[(50.83±9.74)歲]；肝硬化類型：乙型肝炎27例，丙型肝炎6例，酒精性23例，原因不明型3例；肝功能分級：A級33例，B級18例，C級8例。研究組和對照組、感染組和未感染組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

1.2 方法①外周血CD14、TLR2表達(dá)檢測：采集患者外周靜脈血2 ml，取肝素抗凝全血100 μl，加入10 μl單克隆抗體藻紅蛋白標(biāo)記的抗人CD14、TLR-2抗體，充分振蕩混勻，室溫下避光孵育15 min，然后加入溶血素繼續(xù)孵育10 min，離心分離并棄上清液，加入0.3 ml的PBS混勻，于4 ℃下孵育1 h。然后采用流式細(xì)胞儀檢測外周血CD14、TLR2表達(dá)水平，并用平均熒光強(qiáng)度的幾何均數(shù)(GMF)表達(dá)其含量。②感染指標(biāo)檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測PCT、TNF-α水平。

1.3 觀察指標(biāo)①比較感染組、未感染組及對照組外周血CD14、TLR2、PCT和TNF-α水平。②分析外周血CD14、TLR2表達(dá)水平與PCT和TNF-α的相關(guān)性。③分析外周血CD14、TLR2表達(dá)水平對肝硬化感染的預(yù)測價值。④采用Child-Turcotte Pugh(CTP)評分評估患者預(yù)后，其分值低于7分表示預(yù)后良好，7分及以上表示預(yù)后不良，根據(jù)預(yù)后情況將感染組患者分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組，比較外周血CD14、TLR2表達(dá)水平，并分析其對預(yù)后的預(yù)測價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關(guān)性分析采用Pereson相關(guān)分析；診斷及預(yù)測價值分析采用受試者工作曲線(ROC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血CD14、TLR2、PCT和TNF-α水平比較感染組外周血CD14、TLR2、PCT和TNF-α水平均高于未感染組及對照組(P<0.05)。見表1。

表1 三組外周血CD14、TLR2、PCT和TNF-α水平比較

2.2 外周血CD14、TLR2表達(dá)水平與PCT和TNF-α的相關(guān)性外周血CD14、TLR2均與PCT、TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 外周血CD14、TLR2表達(dá)水平與PCT和TNF-α的相關(guān)性

2.3 外周血CD14、TLR2表達(dá)水平對肝硬化感染的預(yù)測價值外周血CD14診斷肝硬化感染的曲線下面積(AUC)為0.724，敏感度為62.22%，特異度為96.61%，診斷閾值為>304.86；TLR2診斷肝硬化感染的AUC為0.903，敏感度為82.22%，特異度為93.22%，診斷閾值為>36.89；兩者聯(lián)合的AUC為0.953，顯著高于單一診斷(P<0.05)。見圖1。

圖1 外周血CD14、TLR2表達(dá)診斷肝硬化感染的ROC曲線

2.4 不同預(yù)后患者外周血CD14、TLR2表達(dá)水平

預(yù)后良好組外周血CD14、TLR2表達(dá)水平顯著低于預(yù)后不良組，外周血CD14預(yù)測預(yù)后的AUC為0.743，敏感度為66.67%，特異度為81.48%，預(yù)測閾值為>311.43；外周血TLR2預(yù)測預(yù)后的AUC為0.900，敏感度為88.89%，特異度為85.19%，預(yù)測閾值為>42.55；兩者聯(lián)合的AUC為0.936，顯著高于單一診斷(P<0.05)。見表3和圖2。

表3 不同預(yù)后患者外周血CD14、TLR2表達(dá)水平

圖2 外周血CD14、TLR2表達(dá)水平預(yù)測肝硬化感染預(yù)后的ROC曲線

3 討論

肝硬化患者易合并細(xì)菌感染，多以自發(fā)性腹膜炎、肺部感染為主，有學(xué)者針對肝硬化并發(fā)患者的細(xì)菌感染種類進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)具體細(xì)菌分布中以肺炎克雷伯桿菌為主，其次為大腸桿菌、金黃色葡萄桿菌、草綠色鏈球菌[7]。肝硬化患者受疾病因素影響，機(jī)體長期處于免疫功能抑制狀態(tài)，因此肝硬化并發(fā)感染時免疫功能變化可能與非肝硬化患者不一致，感染引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)不僅會加重患者肝功能損傷，還會并發(fā)全身多臟器衰竭，增加患者死亡風(fēng)險。PCT作為感染標(biāo)志物，既往研究發(fā)現(xiàn)PCT對于肝硬化并發(fā)感染具有較好的診斷價值[8]，但該指標(biāo)的檢測性能是未知的，沒有臨床驗證的、可重現(xiàn)的臨界值，無法準(zhǔn)確診斷或排除感染，因此仍需進(jìn)一步探索診斷價值更高的臨床檢測指標(biāo)。

TLRs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類病原模式識別受體，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中，尤其是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞特異性識別病原、分泌促炎因子中具有重要作用，同時可調(diào)控誘導(dǎo)機(jī)體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障[9]。TLRs成員有10個，其中TLR2研究較多，該受體主要識別革蘭氏陽性菌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有廣泛的配體特異性，可協(xié)助TLR4參與人體內(nèi)對脂多糖的反應(yīng)[10]。CD14也是天然免疫中重要的模式識別分子，可與TLR2共同介導(dǎo)G+細(xì)菌成分與細(xì)胞的反應(yīng)。既往已有部分研究表明肝硬化并發(fā)感染患者外周血CD14+、單核細(xì)胞TLR2表達(dá)水平存在異常變化[11，12]。本研究結(jié)果也顯示感染組患者外周血CD14、TLR2表達(dá)水平均顯著高于未感染組以及對照組患者，提示外周血CD14、TLR2表達(dá)水平與肝硬化患者感染的發(fā)生密切相關(guān)，與既往研究結(jié)果一致。PCT是一種細(xì)菌感染后刺激細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)，在正常人體內(nèi)水平較低，但當(dāng)出現(xiàn)細(xì)菌或真菌感染時，血液中PCT水平可急劇上升，被認(rèn)為是較好的急性感染參數(shù)[13]；TNF-α的水平升高多是由細(xì)菌內(nèi)毒素對機(jī)體的刺激引起的，其高水平可刺激相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生，從而引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)[14]。故本研究以PCT、TNF-α為感染標(biāo)志物，進(jìn)一步分析外周血CD14、TLR2與感染的相關(guān)性，結(jié)果顯示感染組患者PCT和TNF-α水平均顯著高于未感染組以及對照組患者，且外周血CD14、TLR2均分別于PCT、TNF-α水平呈正相關(guān)，提示外周血CD14、TLR2表達(dá)水平的異常變化與肝硬化患者炎癥狀態(tài)密切相關(guān)，且對于感染診斷具有較高的臨床預(yù)測價值，可作為肝硬化患者臨床監(jiān)測指標(biāo)。肝硬化患者因肝功能嚴(yán)重受損、免疫功能降低，易并發(fā)各種感染，而在感染期間通過趨化因子、白三烯等重要調(diào)節(jié)性因子、TLRs表達(dá)等引起中性粒細(xì)胞功能受損，隨著感染的進(jìn)展，中性粒細(xì)胞基因表達(dá)發(fā)生變化，從而引起抑炎反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)基因抑制[15]，故表現(xiàn)為隨著PCT、TNF-α水平的升高，外周血CD14、TLR2表達(dá)水平也隨之升高。本研究的創(chuàng)新點在于不僅對外周血CD14、TLR2表達(dá)水平的診斷價值進(jìn)行分析，還深入分析了該指標(biāo)對肝硬化并發(fā)感染患者預(yù)后的預(yù)測價值，結(jié)果提示外周血CD14、TLR2表達(dá)水平的異常變化與患者疾病變化密切相關(guān)，可較好預(yù)測預(yù)后。

綜上所述，外周血CD14、TLR2表達(dá)水平對肝硬化并發(fā)感染患者具有較高的診斷以及預(yù)后預(yù)測價值，與機(jī)體炎癥反應(yīng)狀態(tài)密切相關(guān)，可作為臨床治療預(yù)后評估指標(biāo)。但本研究仍存在不足之處，受病例數(shù)限制，未針對肝硬化患者感染程度以及感染類型深入分析，且為單中心小樣本研究，研究結(jié)果仍不具備普遍性，還有待于后續(xù)進(jìn)一步論證結(jié)果。