劉海龍，李 娟，蒲雪峰，龍樹林，滕 蕓

(四川省岳池縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 廣安 638300)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，且近年來該病的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。相關(guān)研究表示，宮頸癌盡早干預(yù)患者預(yù)后較好，故尋找有效的分子標(biāo)記物用來評價(jià)宮頸癌患者預(yù)后有重要意義[2]。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，可與靶細(xì)胞受體結(jié)合，經(jīng)過不同的信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活和凋亡等生物學(xué)作用[3]。而酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TrkA)是NGF的其中一類受體，相關(guān)研究表示，當(dāng)NGF與TrkA結(jié)合可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成，考慮與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[4]。此外，B7-H4作為B7家族新發(fā)現(xiàn)的成員，研究表示其可抑制T細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答，被臨床認(rèn)為對早期宮頸癌具有診斷價(jià)值；然而其表達(dá)與宮頸癌患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系尚不明確[5]。本研究就宮頸癌NGF、TrkA及B7-H4的表達(dá)情況及與病理特征、預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院病理科于2016年6月至2018年6月經(jīng)術(shù)后病理確診為宮頸癌的109例患者臨床資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者有明確的病理學(xué)診斷依據(jù)，均確診為宮頸癌；②入組前未接受放療及化療；③臨床資料完整且真實(shí)；排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并血液疾病者；②嚴(yán)重精神疾患或癡呆等無法配合本研究者；③合并其他原發(fā)性惡性腫瘤者；④中途退出研究者。年齡20～60歲[(35.71±3.82)歲]。收集腫瘤組織及腫瘤旁的正常宮頸黏膜組織，分別作為癌組織組(n=109)和癌旁正常組織組(n=109)。本研究均經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署相關(guān)知情同意。

1.2 NGF、TrkA及B7-H4水平檢測方法

1.2.1儀器與試劑 SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、免疫組織化學(xué)二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)、兔抗人B7-H4抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、兔單克隆NGF抗體(美國 Abcam公司)、兔單克隆TrkA抗體(美國Abcam公司)。

1.2.2檢測方法 采集所有研究對象宮頸癌組織及癌旁組織，使用生理鹽水清洗表面后保存在10%甲醛溶液中并置于-80 ℃恒溫箱，分為三份。NGF、TrkA及B7-H4水平的檢測采用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行：鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)[6]，石蠟切片標(biāo)本厚2 μm，烘烤60 ℃，二甲苯脫蠟，浸泡3次。3次離子水中浸泡抗原修復(fù)切片，磷酸鹽緩沖液(PBST)洗3次。內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑滴加，室溫孵育15 min，沖洗。一抗滴加，室溫孵育1 h，沖洗。辣根酶標(biāo)羊抗小鼠/兔 IgG聚合物滴加，室溫孵育30 min。對照組采用磷酸鹽緩沖液(PBS) 代替一抗；滴加山羊抗兔二抗(eBioscience)室溫孵育 30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，樹膠封片。

1.3 結(jié)果判斷判斷NGF、TrkA及B7-H4蛋白范圍的標(biāo)準(zhǔn)：每張切片在鏡下分別以低倍鏡及高倍鏡進(jìn)行觀察，對每張切片上中下及里外中9個(gè)位置進(jìn)行觀察，最后對2位專家判斷結(jié)果進(jìn)行比對(差異較大時(shí)，需重新同時(shí)共同讀片確定)。采用Volm雙評分法[7]進(jìn)行判定，在染色均勻的腫瘤區(qū)，選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，按陽性細(xì)胞百分率(A值)評分：<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分；按染色強(qiáng)度(B值)評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合染色陽性細(xì)胞數(shù)與染色強(qiáng)度判斷結(jié)果[8]：陰性(-)：0分，弱陽性(+)：1～2分，中度陽性(++)：3～4分，強(qiáng)陽性(+++)：5～6分；兩種計(jì)分的乘積為每例的加權(quán)分?jǐn)?shù)，加權(quán)分?jǐn)?shù)為0為陰性，其余均為陽性。

1.4 隨訪所有患者治療結(jié)束后通過電話、微信、到院復(fù)診等方式進(jìn)行隨訪2年，隨訪截止日期為2020年6月30日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，行χ2檢驗(yàn)；采用多元Logistic回歸分析影響宮頸癌患者預(yù)后生存的危險(xiǎn)因素；采用ROC分析NGF、TrkA及B7-H4對宮頸癌患者預(yù)后生存的預(yù)測價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組NGF、TrkA及B7-H4的表達(dá)情況比較宮頸癌組織中NGF、TrkA及B7-H4陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組NGF、TrkA及B7-H4的表達(dá)情況比較 [n(%)]

圖1 宮頸癌組織免疫組化染色圖(×500) A：NGF陽性表達(dá)；B：NGF陰性表達(dá)；C：TrkA陽性表達(dá)；D：TrkA陰性表達(dá)；E：B7-H4陽性表達(dá)；F：B7-H4陰性表達(dá)

2.2 NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者不同病理參數(shù)的比較有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期處于Ⅱa期、宮頸間質(zhì)浸潤深度>1/2 mm、組織分化為G2、G3的患者NGF、TrkA及B7-H4陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期處于Ⅰb期、宮頸間質(zhì)浸潤深度≤1/2 mm、組織分化為G1的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者不同病理參數(shù)的比較

2.3 宮頸癌患者預(yù)后情況109例患者經(jīng)兩年隨訪后顯示，患者2年生存率為59.63%(65/109)。

2.4 影響宮頸癌患者預(yù)后生存的單因素分析表3顯示，不同F(xiàn)IGO分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、宮頸間質(zhì)浸潤深度、腫瘤直徑、NGF、TrkA及B7-H4的宮頸癌患者生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而不同年齡、宮旁浸潤患者的生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 影響宮頸癌患者預(yù)后生存的單因素分析

2.5 影響宮頸癌患者預(yù)后生存的多因素分析表4顯示，F(xiàn)IGO分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、宮頸間質(zhì)浸潤深度、NGF、TrkA及B7-H4是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

表4 影響宮頸癌患者預(yù)后生存的多因素分析

2.6 NGF、TrkA及B7-H4對宮頸癌患者預(yù)后生存的預(yù)測價(jià)值采用ROC曲線分析 NGF、TrkA及B7-H4及三者聯(lián)合對宮頸癌患者預(yù)后生存的預(yù)測價(jià)值，NGF、TrkA及B7-H4及三者聯(lián)合曲線下面積分別為0.761、0.733、0738、0.853，各指標(biāo)曲線下面積以聯(lián)合檢測最大。見表5、見圖2。

表5 NGF、TrkA及B7-H4對宮頸癌患者預(yù)后生存的預(yù)測價(jià)值

圖2 NGF、TrkA及B7-H4對宮頸癌患者預(yù)后生存的預(yù)測價(jià)值

3 討論

近年來我國宮頸癌發(fā)病率逐年上升，盡管目前宮頸癌的外科手術(shù)已取得長足的進(jìn)步，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及死亡的風(fēng)險(xiǎn)仍較高[9]。本研究顯示，109例宮頸癌患者死亡率為40.36%，基本與既往研究相似，故尋求有效治療靶點(diǎn)對降低宮頸癌患者死亡率有重要意義。

NGF是一種多功能、多肽性的物質(zhì)，通過與靶細(xì)胞表面上的神經(jīng)生長因子受體結(jié)合，介導(dǎo)發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)[10]。NGF一方面可作為絲裂原促進(jìn)腫瘤分離、增殖；另一方面還可以通過自分泌和旁分泌作用促進(jìn)骨髓瘤、纖維肉瘤、胃癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的血管新生及神經(jīng)周圍浸潤[11，12]。而TrkA是trkA原癌基因編碼的產(chǎn)物，對 NGF親和力高，具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性，是NGF的功能性受體[13]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TrkA與NGF結(jié)合，可形成跨膜氨基酸激酶gp140 Trk 組成二聚體，催化酪氨酸殘基磷酸化，增強(qiáng)酪氨酸激酶活性；同時(shí)，在ras原癌基因的協(xié)助下，使信號向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)，激活RAS-MAPK通路，影響基因翻譯、轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長；影響惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[14]。此外，B7-H4是B7家族近年來研究較廣泛的共刺激分子，通過抑制T淋巴細(xì)胞增殖，控制細(xì)胞周期，降低細(xì)胞因子產(chǎn)生發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答作用，對機(jī)體內(nèi)環(huán)境維持具有重要意義[15]。Lin[16]表示B7-H4分子異常表達(dá)可使機(jī)體對腫瘤免疫監(jiān)視發(fā)展為免疫耐受，引發(fā)腫瘤免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。目前已在前列腺癌、宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤證實(shí)關(guān)系密切[17]。而本研究顯示宮頸胃癌組織組NGF、TrkA及B7-H4陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織組，且與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，與既往Faulkner[18]等學(xué)者對宮頸癌中研究一致，說明NGF、TrkA及B7-H4在宮頸癌患者中惡變程度、侵襲轉(zhuǎn)移中占有重要作用。

同時(shí)，為明確影響宮頸癌患者預(yù)后影響的危險(xiǎn)因素，研究對宮頸癌患者進(jìn)行為期2年隨訪發(fā)現(xiàn)，患者死亡率為40.36%。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4與宮頸癌細(xì)胞胞增殖和凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)有關(guān)蛋白相互作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮作用，其水平與宮頸癌患者3年生存率密切相關(guān)[19]。而相關(guān)國外研究也曾表示，NGF表達(dá)水平可作為宮頸癌患者疾病程度與預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志[20]。本研究予以Logistic回歸分析中顯示，F(xiàn)IGO分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤深度、NGF、TrkA及B7-H4是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。與上述研究一致，有力證明了NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者關(guān)系密切。此外，本文為深入了解NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者預(yù)后生存的價(jià)值，本研究采用ROC曲線研究顯示，三者水平聯(lián)合檢測最大，進(jìn)一步證實(shí)NGF、TrkA及B7-H4與宮頸癌患者預(yù)后死亡的重要指標(biāo)；考慮與NGF、TrkA及B7-H4通過參與腫瘤細(xì)胞的分化、浸潤和轉(zhuǎn)移影響宮頸癌患者臨床結(jié)局。但本研究由于納入的樣本量有限，研究結(jié)果有待通過進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量或多中心合作研究予以證實(shí)。

綜上所述，NGF、TrkA及B7-H4在宮頸癌組織中呈異常表達(dá)狀態(tài)；其表達(dá)水平與患者的腫瘤臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)，可作為預(yù)測宮頸癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。