楊 明，邢 坤，袁五營，杜佳輝，白 楊

(1.河南省周口市第五人民醫(yī)院，河南 周口 466000；2.河南省胸科醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3.陜西省榆林市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 榆林 719000)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者接受外科手術(shù)進(jìn)行治療后能夠有效延長其生存期，但部分患者經(jīng)根治術(shù)治療后預(yù)后仍不樂觀，NSCLC患者根治術(shù)后3年生存率為53.8%[1]。為改善NSCLC患者的治療，發(fā)現(xiàn)簡便的預(yù)后指標(biāo)對于改善治療決策至關(guān)重要[2]。有研究顯示，錯配切除修復(fù)蛋白1(Excision repair cross complement 1，ERCC1)、核苷酸還原酶M1(ribonucleotide reductaseM1，RRM1)可識別和切除修復(fù)損傷基因片段，通過影響核苷酸切除修復(fù)途徑參與癌癥進(jìn)程，抑癌基因乳腺癌易感基因1(Breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)也可通過DNA調(diào)控通路提高細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的能力，與癌癥進(jìn)程密切相關(guān)，故上述三者均可初步預(yù)測癌癥患者的生存趨勢[3]。BRCA1在乳腺癌患者診治及預(yù)后預(yù)測中發(fā)揮重要作用[4]，但BRCA1 微小核苷酸(microRNA，mRNA)表達(dá)變化與NSCLC的關(guān)系仍有探討之處。本研究回顧性分析肺癌組織中ERCC1、RRM1、BRCA1表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014年1月至2016年1月在河南省周口市第五人民醫(yī)院行肺癌根治術(shù)的72例NSCLC患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)檢查、病理學(xué)檢查確診為NSCLC者；②均接受肺癌根治術(shù)者；③術(shù)前無放化療等其他抗癌治療者；④術(shù)后接受規(guī)律隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理確診為小細(xì)胞肺癌者；②合并其他全身性疾病、其他惡性腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。所有患者均隨訪3年。

1.2 方法免疫組化法：切片脫蠟水化后抗原修復(fù)10 min；滴加適量的血清封閉液，在室溫下孵育30 min；分別滴加適當(dāng)稀釋后的ERCC1、BRCA1、RRM1一抗(abcam公司)，4 ℃過夜；37 ℃復(fù)溫后滴加二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化沖洗；脫水、透明、封片。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：Trizol法(美國Invitrogen公司)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(日本Takara公司)，進(jìn)行PCR檢測。引物(上海生工生物公司合成)序列見表1，PCR反應(yīng)：94 ℃ 3 min(預(yù)變性)、94 ℃ 30 s(變性)、53.8 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 30 s(延伸)，變性、退火30次，72 ℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參，miRNA的相對表達(dá)量表示為2-ΔΔCt。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 評估標(biāo)準(zhǔn)[6]每張切片隨機(jī)觀測5個高倍視野(×400)，根據(jù)陽性細(xì)胞占比及染色強(qiáng)度進(jìn)行評分[5]，RRM1、ERCC1染色強(qiáng)度分別計(jì)分1～3分，陽性細(xì)胞占比分別計(jì)分1～3分，總分=陽性細(xì)胞占比得分×染色強(qiáng)度得分，總分≥4分為陽性，<4分為陰性。BRCA1陽性染色為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒，染色強(qiáng)度分別計(jì)分0～3分，陽性細(xì)胞占比分別計(jì)分0～3分，總分=陽性細(xì)胞占比得分×染色強(qiáng)度得分，總分≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用K-M法繪制生存函數(shù)曲線，Log-Rank法比較生存期；檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織免疫組化結(jié)果肺癌組織免疫組化圖中可見ERCC1、RRM1、BRCA1在細(xì)胞核中均呈現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1)。

圖1 肺癌組織ERCC1、RRM1、BRCA1免疫組化圖(蘇木素-伊紅染色法，×400倍) a：ERCC1陽性；b：RRM1陽性；c：BRCA1陽性

2.2 肺癌及癌旁組織ERCC1、RRM1、BRCA1蛋白表達(dá)及BRCA1 mRNA相對表達(dá)量比較癌組織ERCC1、RRM1、BRCA1表達(dá)陽性率及BRCA1 mRNA相對表達(dá)量均高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 肺癌及癌旁組織ERCC1、RRM1、BRCA1蛋白表達(dá)及BRCA1 mRNA相對表達(dá)量比較

2.3 ERCC1、RRM1、BRCA1陽性、陰性者及BRCA1 mRNA表達(dá)量高低者臨床病理資料比較以BRCA1 mRNA表達(dá)量的中位數(shù)(1.10)為界，將72例NSCLC患者分為高表達(dá)32例(>1.10)和低表達(dá)40例(≤1.10)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率比較：ERCC1陽性>ERCC1陰性、RRM1陽性>RRM1陰性、BRCA1 mRNA高表達(dá)>BRCA1 mRNA低表達(dá)(P<0.05)。見表2。

表2 ERCC1、RRM1、BRCA1陽性、陰性者臨床病理資料比較 [n(%)]

2.4 不同ERCC1、RRM1、BRCA1表達(dá)情況的NSCLC患者3年生存情況比較3年總生存率、3年無病生存率、中位生存期比較，ERCC1、RRM1陽性者均低于陰性者，BRCA1 mRNA高表達(dá)者均低于低表達(dá)者(P<0.05)，見表3。

表3 不同ERCC1、RRM1、BRCA1表達(dá)情況的NSCLC患者3年生存情況比較

2.5 ERCC1、RRM1、BRCA1陽性與陰性者及BRCA1 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)者生存期比較生存期比較：ERCC1陽性0.05)。見圖2～圖5。

圖2 ERCC1陽性與陰性者生存期比較

圖3 RRM1陽性與陰性者生存期比較

圖4 BRCA1陽性、陰性者生存期比較

圖5 BRCA1 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)者生存期比較

3 討論

除外科手術(shù)外，放化療等內(nèi)科治療方法也是治療肺癌的重要方法。其中鉑類藥物在NSCLC化療中應(yīng)用較多，但DNA修復(fù)的能力、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性及代謝相關(guān)基因多態(tài)性等均會影響NSCLC鉑類藥物化療效果[7]。已有部分相關(guān)報(bào)道顯示，鉑類化療方案的療效與DNA修復(fù)相關(guān)的ERCC1、BRCA1表達(dá)密切相關(guān)[8]。故RRM1、ERCC1表達(dá)水平可能通過影響NSCLC患者化療效果，影響患者預(yù)后情況。

本研究結(jié)果提示NSCLC中ERCC1、RRM1和BRCA1均趨向于高表達(dá)。ERCC1基因發(fā)生突變可導(dǎo)致ERCC1蛋白表達(dá)水平發(fā)生異常，異常激活核酸修復(fù)過程，導(dǎo)致正常肺組織細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[9]。DNA損傷修復(fù)過程中的限速酶RRM1高表達(dá)時(shí)，惡性腫瘤細(xì)胞的增殖能力得到增強(qiáng)，有助于其遷移、侵襲及其耐藥性的增加[10]。此外，BRCA1也是調(diào)節(jié)DNA代謝和損傷修復(fù)的核酸分子[11]。故在肺癌組織中ERCC1、RRM1和BRCA1基因突變導(dǎo)致ERCC1、RRM1和BRCA1蛋白高表達(dá)，使正常細(xì)胞惡變和肺癌細(xì)胞增殖。本組數(shù)據(jù)顯示，ERCC1、RRM1蛋白高表達(dá)會使患者更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。通常而言，肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與其惡性程度和腫瘤大小相關(guān)[12]，與本研究結(jié)論不符?；厮菅芯繑?shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，本研究對象均為Ⅱ期以上NSCLC，且各蛋白表達(dá)陰性者均較少。但本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織BRCA1 mRNA相對表達(dá)量更高。BRCA1是一種抑癌基因，但其氨基末端的1個鋅指結(jié)構(gòu)域及羧基末端的2個串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變后，會導(dǎo)致BRCA1錯位表達(dá)，促使其在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中轉(zhuǎn)化為類似致癌基因的角色，導(dǎo)致細(xì)胞惡變[13]。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者BRCA1 mRNA高表達(dá)者表現(xiàn)出更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。同時(shí)，本研究隨訪發(fā)現(xiàn)，ERCC1、RRM1蛋白表達(dá)水平和BRCA1 mRNA相對表達(dá)量與NSCLC患者預(yù)后情況關(guān)系緊密。術(shù)后輔助化療有利于清除根治術(shù)后機(jī)體殘存惡性腫瘤細(xì)胞，改善患者預(yù)后。鉑類藥物治療機(jī)制是藥物在細(xì)胞中水解轉(zhuǎn)變?yōu)殡p氯雙氨鉑作用于DNA，交叉聯(lián)結(jié)形成DNA-鉑類復(fù)合物，破壞了DNA分子的結(jié)構(gòu)，擾亂DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致DNA鏈合成終止，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞受損壞死[13]。但ERCC1、RRM1、BRCA1各蛋白過表達(dá)會增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)能，使鉑類化療藥物產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)也會增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖活性機(jī)能，使腫瘤更易生成微轉(zhuǎn)移病灶，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，導(dǎo)致不良預(yù)后。

綜上所述，肺癌組織中ERCC1、RRM1和BRCA1均高表達(dá)，ERCC1、RRM1蛋白陽性與BRCA1 mRNA高表達(dá)會影響NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且能在一定程度上預(yù)測患者預(yù)后情況。