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        大承氣湯抑制高遷移率族蛋白1- Toll樣受體4信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)改善重癥胰腺炎大鼠腎損傷

        2021-09-22 01:21:04艻,王
        實(shí)用醫(yī)院臨床雜志 2021年5期
        關(guān)鍵詞:血清

        王 艻,王 佳

        (1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科,湖北 武漢 443000;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院全科,四川 成都 610072)

        重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床常見的急腹癥,占急性胰腺炎的10%~20%。具有發(fā)病快、進(jìn)展快、并發(fā)癥多、預(yù)后差的特點(diǎn)[1]。此外,早期還可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS),死亡率為10%~30%[1]。Devani 等[2]研究顯示SAP并發(fā)腎臟損傷時(shí)死亡率高達(dá)14.5%。相關(guān)研究證實(shí)炎癥反應(yīng)與SAP誘發(fā)的腎損傷發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3],而大承氣湯可通過抑制炎癥反應(yīng)減輕SAP[4]。本研究擬探討大承氣湯對重癥急性胰腺炎大鼠腎損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2018年1月至2020年12月在四川省人民醫(yī)院開展本研究。SPF級雄性SD大鼠60只,體重為(210±20) g,購買于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXL (鄂) 2013-012。

        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑血清淀粉酶(amylase,AMS)、脂肪酶(LIS)、肌酐(Cr),高遷移率族蛋白1(HMGB1)和尿素氮(BUN)活性以及白介素-6(IL-6),單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒均買于南京建成生物研究所。牛磺膽酸鈉(Sigma,USA),大承氣湯(厚樸 24 g,大黃 12 g,芒硝 6 g,枳實(shí) 12 g)購自于上海雷允公司,利用水提醇沉法制作大承氣湯凍干粉),濃縮至生藥量為(1.2 g/ml)。重組HMGB1(r-HMGB1)購買于Sigma 公司,Acetyl-HMGB1,HMGB1,TLR-4,Myd88,p-p65 和p65 一抗均購買于美國Abgent 公司。HE染色試劑由四川省人民醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室提供。水合氯醛(武漢谷歌),實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑盒購自TOYOBO 公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)分組和模型構(gòu)建60只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham)、重癥急性胰腺炎組(SAP)、大承氣湯治療組(DCQD)和r-HMGB1組各15只。SAP組,DCQD組和r-HMGB1組通過十二指腸壁經(jīng)胰膽管逆行注射?;悄懰徕c構(gòu)建重癥急性胰腺炎模型[4],Sham組操作同上,但不注射?;悄懰徕c。DCQD組在術(shù)前2 h灌胃給藥(12 g/kg),r-HMGB1組在術(shù)前2 h灌胃給藥(12 g/kg)和r-HMGB1,SAP和Sham組術(shù)后1 h腹腔注射相同生理鹽水[4,5]。術(shù)后12 h通過水合氯醛麻醉處死大鼠,收集血清和腎臟。部分腎組織經(jīng)甲醛固定,脫水,包埋成蠟塊

        1.4 生化指標(biāo)測定利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測血清和腎組織勻漿中AMS、LIS、Cr,HMGB1和BUN的活性以及IL-6、MCP-1 和TNF-α表達(dá)水平,具體步驟參考試劑說明書。

        1.5 腎臟病理形態(tài)檢測取腎臟蠟塊4 μm切片,脫蠟,透明,后行PAS染色,在顯微鏡下評估形態(tài),損傷評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[8]。

        1.6 腎組織IL-6、MCP-1 和TNF-α mRNA表達(dá)測定應(yīng)用(PE Biosystems)軟件設(shè)計(jì)引物序列,嚴(yán)格參照說明書提取腎組織總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA,然后以 cDNA 做、作為模板進(jìn)行Q-PCR。以20 μl 作為反應(yīng)體系,SYBGreen qPCRMix為 10 μl,下游引物(10 μmol/L)為0.4 μl,上游引物(10 μmol/L)為0.4 μl,模板為5 μl,ROX reference dye為0.4 μl 并加入3.8 μl滅菌蒸餾水。擴(kuò)增條件:預(yù)熱 50 ℃ (2 min),預(yù)變性 95 ℃ (10 min),變性 95 ℃ (15 s),退火 60 ℃ (30 s),延伸 72 ℃ (30 s),總共 35 個(gè)循環(huán);并以2-△△Ct 值代表目標(biāo)基因IL-6、MCP-1 和TNF-α mRNA。

        1.7 Western blotting檢測Acetyl-HMGB1,HMGB1,TLR-4,MyD88,p-NF-κB和 NF-κ B表達(dá)將腎組織在磷酸酶抑制劑和RIPA作用下冰上勻漿,提取腎組織總蛋白,利用BCA法檢測蛋白濃度,經(jīng)上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,洗滌,加入一抗Acetyl-HMGB1 (1∶500)、HMGB1 (1∶1000)、TLR-4(1∶400)、Myd88(1∶400)、p-NF-κBp65(1∶500)、p65(1∶1000)和β-actin(1∶3000),4 ℃孵育過夜,洗滌,二抗IgG(1∶400),37 ℃孵育1 h。洗滌,顯影顯色,利用Image G進(jìn)行圖像分析檢測蛋白表達(dá)量(β-actin為內(nèi)參條帶)。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠血清AMS、LIS、Cr和BUN含量的比較與Sham組比較,SAP組血清AMS、LIS、Cr和BUN含量增高;與SAP組比較,DCQD組血清AMS、LIS、Cr和BUN含量降低(P<0.05);與DCQD組比較,r-HMGB1組血清AMS、LIS、Cr和BUN含量增高(P<0.05)。見表1。

        表1 各組大鼠血清AMS、LIS、Cr和BUN含量的比較

        2.2 各組大鼠腎臟病理形態(tài)的比較如圖1所示,Sham組腎小管細(xì)胞形態(tài)大小正常;SAP組可見腎小管刷狀緣缺失,管腔擴(kuò)張或塌陷,細(xì)胞脫離管狀基底膜,炎癥細(xì)胞浸潤及腎臟病理損傷較Sham組明顯增高。與SAP組相比,DCQD組腎小管刷狀緣缺失,管腔擴(kuò)張或塌陷,細(xì)胞脫離管狀基底膜,炎癥細(xì)胞浸潤及腎臟病理損傷評分均減輕。與DCQD組相比,r-HMGB1組腎小管刷狀緣缺失,管腔擴(kuò)張或塌陷,細(xì)胞脫離管狀基底膜,炎癥細(xì)胞浸潤及腎臟病理損傷評分均明顯加重。

        圖1 PAS染色檢測DCQD對腎組織病理損傷影響 a:PAS檢測DCQD對腎組織病理結(jié)構(gòu)的影響(200×); b:腎臟病理損傷評分。***與Sham組比較,P<0.001;#與SAP組比較,P<0.05;&與DCQD組比較,P<0.05

        2.3 各組腎臟Acetyl-HMGB1,HMGB1以及血清中HMGB1蛋白表達(dá)水平比較與Sham組相比,SAP組腎臟Acetyl-HMGB1和血清中HMGB1表達(dá)升高,腎臟HMGB1表達(dá)量降低(P<0.05);與SAP組相比,DCQD組、SAP組腎臟Acetyl-HMGB1和血清HMGB1表達(dá)降低,腎臟HMGB1表達(dá)量增高(P<0.05);與DCQD組相比,r-HMGB1組、SAP組腎臟Acetyl-HMGB1和血清HMGB1表達(dá)升高,腎臟HMGB1表達(dá)量降低(P<0.05)。見圖2。

        圖2 Western blotting和ELISA檢測DCQD對腎臟Acetyl-HMGB1,HMGB1表達(dá)以及血清中HMGB1含量的影響 a:Western blotting檢測Acetyl-HMGB1和HMGB1表達(dá);b:半定量評估Acetyl-HMGB1和HMGB1表達(dá);c:ELISA檢測血清中HMGB1活性。***與Sham組比較,P<0.001;#與SAP組比較,P<0.05;&與DCQD組比較,P<0.05

        2.4 各組腎臟TLR-4、MyD88、p-p65和 p65蛋白表達(dá)水平比較與Sham組相比,SAP組TLR-4、MyD88、p-p65蛋白表達(dá)量增高(P<0.05);與SAP組相比,DCQD組TLR-4、MyD88、p-p65蛋白表達(dá)量降低(P<0.05);與DCQD組相比,r-HMGB1組TLR-4、MyD88、p-p65蛋白表達(dá)量增高(P<0.05),各組p65蛋白表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

        圖3 Western blotting檢測DCQD對腎臟TLR-4、MyD88、p-p65和 p65蛋白表達(dá)影響 a:Western blotting檢測TLR-4、MyD88、p-p65和p65蛋白表達(dá);b:半定量評估TLR-4,MyD88,p-p65和 p65蛋白表達(dá)。***與Sham組比較,P<0.001;#與SAP組比較,P<0.05;&與DCQD組比較,P<0.05

        2.5 各組腎臟中IL-6、MCP-1 和TNF-α mRNA的比較與Sham組相比,SAP組腎臟中IL-6、MCP-1 和TNF-α mRNA表達(dá)水平增高(P<0.05);與SAP組相比,DCQD組腎臟中IL-6、MCP-1 和TNF-α mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);與DCQD組相比,r-HMGB1組腎臟中IL-6、MCP-1 和TNF-α mRNA表達(dá)水平增高(P<0.05)。見表2。

        表2 各組腎臟中IL-6、MCP-1 和TNF-α mRNA的比較

        2.6 各組血清中IL-6、MCP-1 和TNF-α 含量比較

        與Sham組相比,SAP組血清中IL-6、MCP-1 和TNF-α 含量增高(P<0.05);與SAP組相比,DCQD組血清中IL-6、MCP-1 和TNF-α 含量降低(P<0.05);與DCQD組相比,r-HMGB1組血清中IL-6、MCP-1 和TNF-α含量增高(P<0.05)。見表3。

        表3 各組血清中IL-6、MCP-1 和TNF-α 含量比較 (pg/ml)

        2.7 各組腎組織IL-6、MCP-1 和TNF-α 含量比較

        與Sham組相比,SAP組腎組織中IL-6、MCP-1和TNF-α含量增高(P<0.05);DCQD組與SAP組相比,腎組織中IL-6、MCP-1 和TNF-α 含量降低(P<0.05);與DCQD組相比,r-HMGB1組腎臟中IL-6,MCP-1和TNF-α含量增高(P<0.05)。見表4。

        表4 各組腎組織IL-6、MCP-1 和TNF-α 含量比較 (pg/ml)

        3 討論

        繼發(fā)性腎損傷是SAP最常見,最兇險(xiǎn)的胰腺外并發(fā)癥,是導(dǎo)致SAP患者死亡的重要原因之一。既往研究證實(shí)繼發(fā)的腎臟受損程度與SAP的危重程度呈正相關(guān),而腎臟受損程度會(huì)嚴(yán)重影響SAP患者的病程和預(yù)后。因此研究SAP并發(fā)腎損傷的發(fā)病機(jī)制具有重大意義[2,3]。

        本研究通過胰膽管在大鼠逆行注射?;悄懰徕c構(gòu)建SAP模型,結(jié)果顯示血清中AMS、LIS、ALT和AST含量以及腎臟病理損傷均明顯增高,這與既往研究報(bào)道相一致,提示重癥胰腺炎誘導(dǎo)腎臟損傷模型構(gòu)建成功,并進(jìn)一步證實(shí)了SAP可繼發(fā)嚴(yán)重的腎臟損害[3,4]。大承氣湯的主要成分包括厚樸、大黃、芒硝和枳實(shí),其中大黃等多種成分研究發(fā)現(xiàn)具有抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫等功效評[4]。而HMGB-TLR-4介導(dǎo)的炎癥通路在重癥胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,但對SAP繼發(fā)的腎臟損傷作用機(jī)制尚不清楚[3-5]。結(jié)果顯示大承氣湯治療可明顯減輕血清中AMS、LIS、Cr和BUN活性以及腎臟病理損傷,提示大承氣湯可減輕SAP誘發(fā)的腎臟損害。r-HMGB1可明顯增加血清中AMS、LIS、Cr和BUN活性以及腎臟病理損傷,提示r-HMGB1可抑制大承氣湯對SAP誘發(fā)的腎臟損害有保護(hù)作用。

        既往研究顯示炎癥反應(yīng)在SAP誘發(fā)腎臟損害中起重要作用[3]。IL-6、MCP-1和TNF-α是SAP誘發(fā)腎臟損害中最受關(guān)注的炎癥因子[3]。IL-6由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞分泌,可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[6];MCP-1是趨化因子之一,可啟動(dòng)炎癥級聯(lián)反應(yīng),調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌和組織損傷[7]。TNF-α是炎癥的始動(dòng)因子,可調(diào)節(jié)多種炎癥因子釋放如 IL-6,還可促進(jìn)氧自由基和一氧化氮的生成以及白細(xì)胞的趨化和黏附[7]。結(jié)果顯示IL-6、MCP-1和TNF-α在血清和腎臟均明顯增高,進(jìn)一步證實(shí)了炎癥反應(yīng)在SAP誘發(fā)腎臟損害中的關(guān)鍵作用,大承氣湯治療可明顯減少血清和腎臟中IL-6、MCP-1和TNF-α的表達(dá),提示大承氣湯可通過抑制炎癥反應(yīng)減輕SAP誘發(fā)的腎損傷。而r-HMGB1可明顯增加血清和腎臟中IL-6、MCP-1和TNF-α的表達(dá),提示r-HMGB1可減輕大承氣湯對炎癥反應(yīng)的抑制作用HMGB1-TLR4/NF-κB 信號(hào)通路在腎臟炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的樞紐作用[8]。高遷移率族蛋白1是真核細(xì)胞核中的一種非DNA結(jié)合蛋白,是損傷相關(guān)模式分子的典型代表[8]。當(dāng)實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死或受損,以及免疫細(xì)胞激活時(shí),核內(nèi)的HMGB1可由于乙?;揎棇?dǎo)致結(jié)構(gòu)的改變而釋放至胞外,作為內(nèi)源性的“危險(xiǎn)信號(hào)分子”被天然免疫系統(tǒng)識(shí)別,在早期啟動(dòng)免疫反應(yīng),募集免疫效應(yīng)細(xì)胞,“瀑布式”放大免疫反應(yīng),導(dǎo)致炎癥和免疫損傷,成為激活免疫炎癥損傷的“扳機(jī)點(diǎn)[8]。既往研究顯示HMGB1可通過激活廣泛分布在腎臟細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體TLR4在SAP合并器官損傷的發(fā)生及發(fā)展過程中起重要作用[9]。激活的TLR4 可通過激活MYD88引起NF-κB上游的IκB蛋白磷酸化降解以及NF-κBp65 的磷酸化激活,然后促使IL-6、MCP-1和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)[9]。結(jié)果顯示,DCQD治療可明顯減輕SAP誘導(dǎo)的腎臟HMGB1乙酰化的修飾,減少HMGB1的分泌以及腎臟TLR-4、MyD88,p-p65蛋白的表達(dá),而r-HMGB1可減輕DCQD對HMGB1乙?;揎椧种谱饔靡约按龠M(jìn)HMGB1-TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活,提示DCQD可通過抑制HMGB1乙?;揎棧^而抑制HMGB1-TLR-4/NF-κB信號(hào)途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

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