張小壘，蔣冬先，王海星，欒麗娟，宿杰·阿克蘇，黃 潔，侯英勇

食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，我國(guó)的食管癌病死率較高，2014年死亡數(shù)超過(guò)193 000人[1]。每年新發(fā)食管癌中，約90%為食管鱗狀細(xì)胞癌。盡管手術(shù)、化療、放療等治療手段不斷優(yōu)化，但食管鱗狀細(xì)胞癌的5年生存率依然較差[2]。近年隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，尋找可靠的預(yù)后標(biāo)志物將有助于患者選擇合適的治療方案。目前，在多種腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)年齡是影響腫瘤患者預(yù)后的因素[3-5]。p53突變是食管鱗狀細(xì)胞癌中重要的分子事件，雖已有p53蛋白表達(dá)在食管鱗狀細(xì)胞癌中預(yù)后意義的研究報(bào)道，但仍存在爭(zhēng)議。目前年齡是否與食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后有關(guān)，尚缺乏相關(guān)研究[6]。本文著重探討食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征、診斷、鑒別診斷，分析p53在不同年齡段食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及預(yù)后意義，以提高臨床與病理醫(yī)師的認(rèn)識(shí)水平。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2007～2010年復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受食管切除術(shù)的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本536例，術(shù)前均未接受新輔助放、化療。復(fù)習(xí)病理切片，查閱其臨床影像資料，整理臨床病理信息包括年齡、性別、吸煙情況、腫瘤大小、發(fā)病部位、分化程度、脈管侵犯、神經(jīng)束侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及第八版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer, AJCC)TNM分期。

1.2 組織芯片組織芯片制作方法參考Shi等[7]報(bào)道，具體操作如下：(1)復(fù)習(xí)HE切片，挑選、標(biāo)記代表性腫瘤區(qū)域；(2)從供體蠟塊中取出組織條(長(zhǎng)6 mm，寬2 mm)；(3)將組織條依次垂直種植于受體蠟塊；(4)組織聚合。

1.3 免疫組化檢測(cè)徠卡Bond Max全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行p53(克隆號(hào)NCL-L-P53-D07)檢測(cè)。p53陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞核。評(píng)估腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性比例(0～100%)及陽(yáng)性強(qiáng)度(淡黃色+、棕黃色、深棕色)。根據(jù)H-score評(píng)分將病例分為p53不表達(dá)、低表達(dá)和高表達(dá)。不表達(dá)和高表達(dá)歸為p53突變型，低表達(dá)組歸為p53野生型。

1.4 隨訪所有患者均進(jìn)行隨訪。無(wú)瘤生存期(disease free survival, DFS)指從患者手術(shù)日期至出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或因食管癌死亡的時(shí)間?？偵嫫?overall survival, OS)指從患者手術(shù)日期至隨訪截止或患者死亡的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用χ2檢驗(yàn)評(píng)估p53表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法構(gòu)建生存曲線，Log-rank法比較生存差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床病理學(xué)特征536例食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，≥60歲患者的比例為57.3%；男女比為4.5 ∶1；206例(38.4%)有吸煙史；腫瘤平均直徑為3.3 cm。腫瘤主要位于中下段，比例分別為45.0%和45.7%。復(fù)習(xí)所有患者HE切片(圖1A)，腫瘤高、中、低分化的比例分別為3.7%、56.9%和39.4%。117例和181例分別有脈管和神經(jīng)束侵犯；45.5%患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。根據(jù)第八版AJCC的TNM分期，Ⅰ+Ⅱ期患者300例，Ⅲ+Ⅳ期患者236例。

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌中p53表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系依據(jù)H-score(陽(yáng)性強(qiáng)度乘以陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞比例)評(píng)分，p53評(píng)分范圍為0～270分，中位值為60分。以60分為臨界值，不表達(dá)210例(39.2%)，低表達(dá)44例(8.2%)，高表達(dá)282例(52.6%)(圖1B～D)。即44例p53低表達(dá)為野生型組，492例p53不表達(dá)或高表達(dá)病例為突變型組。無(wú)論在<60歲的患者中，還是在≥60歲的患者中，p53蛋白表達(dá)與患者性別、吸煙史、腫瘤大小、發(fā)病部位、分化程度、脈管侵犯、神經(jīng)束侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 不同年齡段食管鱗狀細(xì)胞癌中p53蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 不同年齡段食管鱗狀細(xì)胞癌中p53表達(dá)的預(yù)后意義Kaplan-Meier生存分析顯示，p53不表達(dá)、低表達(dá)及高表達(dá)患者的DFS和OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p53突變型及野生型患者的DFS和OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。<60歲的229例患者中，p53不表達(dá)、低表達(dá)及高表達(dá)組患者的中位DFS分別為47個(gè)月、未達(dá)到(隨訪期間生存率均大于50%，生存率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的生存時(shí)間尚無(wú)法評(píng)估)和39個(gè)月；中位OS分別為59個(gè)月、未達(dá)到和38個(gè)月。p53高表達(dá)組的DFS和OS明顯比低表達(dá)組差(P=0.032，P=0.028)，p53不表達(dá)組的DFS和OS比低表達(dá)組差(P=0.135，P=0.187，圖3A、B)。p53突變型組的DFS和OS比野生型組差(P=0.064，P=0.052，圖3C、D)。在≥60歲的307例患者中，p53不表達(dá)、低表達(dá)及高表達(dá)患者的中位DFS分別為31、32和48個(gè)月；中位OS分別為38、41和52個(gè)月。p53高表達(dá)組、不表達(dá)組的DFS和OS與低表達(dá)組無(wú)明顯差異(P>0.05，圖4A、B)。p53突變型組的DFS和OS與野生型組無(wú)明顯差異(P=0.879，P=0.966，圖4C、D)。

圖3 在<60歲的食管鱗狀細(xì)胞癌患者中p53表達(dá)的預(yù)后意義：A.p53不同表達(dá)組的無(wú)瘤生存期；B.p53不同表達(dá)組的總生存期；C.p53突變組的無(wú)瘤生存期；D.p53突變組的總生存期

圖4 在≥60歲食管鱗狀細(xì)胞癌患者中p53表達(dá)的預(yù)后意義：A.p53不同表達(dá)組的無(wú)瘤生存期；B.p53不同表達(dá)組的總生存期；C.p53突變組的無(wú)瘤生存期；D.p53突變組的總生存期

3 討論

p53是重要的抑癌基因，位于17q13.1，編碼393個(gè)氨基酸組成的p53蛋白。p53蛋白調(diào)節(jié)損傷細(xì)胞進(jìn)入G1期并阻止其進(jìn)入S期，完成DNA損傷修復(fù)，同時(shí)指導(dǎo)損傷細(xì)胞凋亡。p53突變將失去對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[8]。最近研究中發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌中，p53突變率達(dá)90%[9-10]。目前廣泛認(rèn)為免疫組化檢測(cè)p53蛋白表達(dá)，能夠反映p53的突變情況，且操作簡(jiǎn)單易行[6]。除外p53突變，其它基因的相互作用也將影響p53表達(dá)，有必要探索p53蛋白表達(dá)在腫瘤中的意義[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道食管鱗狀細(xì)胞癌p53蛋白陽(yáng)性率為50%～90%[6,11-12]。本組p53蛋白陽(yáng)性率為60.8%。p53表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙、大小、部位、分化程度、脈管侵犯、神經(jīng)束侵犯及臨床分期無(wú)相關(guān)性，與文獻(xiàn)報(bào)道研究一致[6,13]。

目前，p53蛋白表達(dá)的預(yù)后意義尚存在爭(zhēng)議。Sankalecha等[14]研究發(fā)現(xiàn)91例食管鱗狀細(xì)胞癌中，p53低表達(dá)和高表達(dá)率分別為38.46%和61.54%，隨訪1年后發(fā)現(xiàn)p53低表達(dá)組和高表達(dá)組的生存率分別為91.43%和67.86%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Melling等[15]研究發(fā)現(xiàn)260例食管鱗狀細(xì)胞癌中p53陽(yáng)性率為40.0%，p53表達(dá)是患者預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。Murata等[6]對(duì)266例食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行p53蛋白檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53陽(yáng)性率為52%，p53表達(dá)組DFS和OS與不表達(dá)組無(wú)明顯差異(P>0.05)，認(rèn)為p53表達(dá)不能作為食管鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道采用單因素和多因素分析顯示p53表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性[13,16]。本組對(duì)536例食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行p53蛋白檢測(cè)，結(jié)果顯示p53不表達(dá)組、低表達(dá)組和高表達(dá)組的預(yù)后差異無(wú)顯著性。不同研究中出現(xiàn)不同結(jié)果的原因除了樣本大小、p53抗體差異、p53表達(dá)判讀標(biāo)準(zhǔn)不同外，還有人群差異。中國(guó)患者的大樣本研究較少，本組收集536例食管鱗狀細(xì)胞癌中檢測(cè)p53蛋白的表達(dá)，并在不同年齡段患者中分析p53蛋白表達(dá)的預(yù)后意義。

以往研究認(rèn)為≥ 60歲的人群具有較高的食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[17]，60歲通常用于食管鱗狀細(xì)胞癌研究中年齡的分界值。Sankalecha等[14]研究中將患者分為﹤60歲和≥ 60歲組，在≥ 60歲的患者中p53蛋白陽(yáng)性率較高。在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院的食管癌研究中，將60歲患者分為低年齡組和高年齡組[18]。本組將60歲作為年齡的分界值，探索p53在2個(gè)年齡段中的表達(dá)。本組發(fā)現(xiàn)低年齡組中p53不表達(dá)、低表達(dá)和高表達(dá)的陽(yáng)性率分別為39.3%、9.2%和51.5%；高年齡組中p53不表達(dá)、低表達(dá)和高表達(dá)的陽(yáng)性率分別為39.1%、7.5%和53.4%，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在低年齡組中p53高表達(dá)患者預(yù)后明顯低于p53低表達(dá)患者，且p53不表達(dá)患者有相同的預(yù)后趨勢(shì)。在高年齡組中p53不表達(dá)、低表達(dá)和高表達(dá)的患者，預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在乳腺癌、血液系統(tǒng)腫瘤均發(fā)現(xiàn)不同年齡分層中分子突變等事件發(fā)生率存在較大差異，提示可能存在不同的機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。需要進(jìn)一步的分子機(jī)制研究，探索p53蛋白表達(dá)在不同年齡段食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展中的作用。

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)估和分析了食管鱗狀細(xì)胞癌中p53蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性，并且進(jìn)一步在不同年齡段患者中評(píng)估其預(yù)后意義。p53突變(高表達(dá)和不表達(dá))可能是較年輕食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的影響因素，其有望為患者的個(gè)體化診療和預(yù)后提供幫助。