姚嘉赟，張成賽，尹文林，藺凌云，潘曉藝，曹 錚，劉憶翰，夏炎春，沈錦玉

( 1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313001； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118 )

多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)，屬纖毛門、寡膜綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬[1]。其生活史分為滋養(yǎng)體、包囊體和掠食體3個(gè)階段。滋養(yǎng)體主要寄生在宿主體表，當(dāng)滋養(yǎng)體發(fā)育成熟并離開魚體后，分泌一層透明而有彈性的物質(zhì)將自身包裹形成包囊，再經(jīng)有絲分裂形成掠食體，掠食體出包囊后又可感染其他魚體[2]。多子小瓜蟲幾乎可以感染所有淡水魚類，給世界范圍的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

疫苗被認(rèn)為是一種防治多子小瓜蟲病的有效手段，大量研究結(jié)果表明，甲醛或者冰凍處理多子小瓜蟲幼蟲滅活疫苗具有一定的免疫保護(hù)力[5]，但目前還不能解決多子小瓜蟲離體培養(yǎng)這一難題，難以獲得大量的抗原，因而缺乏實(shí)際的可操作性?？兹甘G(四甲基代二氨基三苯甲烷)和硝酸亞汞被認(rèn)為是較為有效的殺蟲物質(zhì)，但因其致癌性目前已被禁用[6]。甲醛[7]、硫酸銅[8]、過氧化氫[9]、過氧乙酸[10]、過碳酸鈉[11]、溴硝醇[12-13]、高鐵酸鉀[14]等被用于控制多子小瓜蟲病，雖有一定功效，但長(zhǎng)期使用也會(huì)帶來環(huán)境污染、藥物殘留、蟲體產(chǎn)生耐藥性等一系列問題。因此，尋找治療多子小瓜蟲病行之有效、環(huán)境友好型的藥物迫在眉睫。姚嘉赟等[15-16]用活性追蹤方法從博落回和小果博落回中分離獲得3種苯菲啶異喹啉類化合物血根堿、二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿，藥效結(jié)果顯示，3種物質(zhì)對(duì)多子小瓜蟲具有較強(qiáng)的殺滅作用。同時(shí)，構(gòu)效關(guān)系研究初步表明其核心藥效基團(tuán)主要為四氫異喹啉。因此，筆者以苯乙醇為起始原料，對(duì)醇基的α位碳上的氫進(jìn)行取代，然后經(jīng)還原、?；蚧酋；Ｗo(hù)氨基，關(guān)環(huán)，皮克特—施彭格勒反應(yīng)，脫去保護(hù)基團(tuán)等反應(yīng)合成3種N-取代四氫異喹啉衍生物，研究其殺蟲功能，以期研制開發(fā)新型的殺蟲藥物。

1 材料與方法

1.1 N-取代四氫異喹啉衍生物的合成及鑒定

以對(duì)位被不同取代基取代苯乙醇為起始原料，對(duì)醇基的α位碳上的氫進(jìn)行取代，經(jīng)還原、?；蚧酋；Ｗo(hù)氨基，關(guān)環(huán)，皮克特—施彭格勒反應(yīng)，脫去保護(hù)基團(tuán)等反應(yīng)合成3種四氫異喹啉類衍生物：化合物1(R=CH3NH1-)、化合物2(R=C2H6NH1-)、化合物3[R=CH3(CH2)2NH1-]，并對(duì)其進(jìn)行分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定，合成過程見圖1。

圖1 N-取代四氫異喹啉衍生物的合成過程Fig.1 Synthetic process of N-substituted-tetrahydroisoquinoline derivatives1.R=CH3NH1-； 2.R=C2H6 NH1-； 3.R=CH3(CH2)2NH1-.

1.2 體外殺蟲藥效試驗(yàn)

1.2.1 蟲體的收集

將嚴(yán)重感染多子小瓜蟲的翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaeformis)飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室的階梯式養(yǎng)殖水槽中，在養(yǎng)殖水槽的底部放入大量自制的蟲體玻璃收集器，待魚體上的多子小瓜蟲游出魚體，沉入水體底部的玻璃收集器后，收集蟲體。一部分蟲體放入22 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，獲取多子小瓜蟲掠食體進(jìn)行殺蟲試驗(yàn)。另一部分吸取收集后放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，進(jìn)行體外包囊藥物試驗(yàn)。

1.2.2 藥物對(duì)多子小瓜蟲掠食體的體外殺蟲試驗(yàn)

將合成的所有藥物用二甲基亞砜進(jìn)行溶解，進(jìn)而根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果配制不同質(zhì)量濃度的藥物，化合物1的質(zhì)量濃度為6、8、10、12、14、16、18、20 mg/L，化合物2的質(zhì)量濃度為10、12、14、16、18、20、22、24 mg/L，化合物3的質(zhì)量濃度為10、13、16、19、22、25、28、31 mg/L，吸取150 μL的藥物于24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中。收集多子小瓜蟲掠食體，并放置在燒杯中進(jìn)行稀釋，使其密度約200個(gè)/μL，待藥物加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿后于每個(gè)藥物孔中加入0.5 μL的蟲體，并用槍頭進(jìn)行混勻。試驗(yàn)設(shè)置一個(gè)空白藥物對(duì)照組和一個(gè)二甲基亞砜對(duì)照組(前期試驗(yàn)表明藥物中所添加的最高含量二甲基亞砜對(duì)多子小瓜蟲掠食體沒有毒性)。每個(gè)藥物質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行。用藥后觀察多子小瓜蟲的死亡情況，統(tǒng)計(jì)每個(gè)藥物質(zhì)量濃度下的4 h死亡率，進(jìn)而計(jì)算殺蟲率(R，%)：

R=n1/n×100%

式中，n1為用藥組死亡蟲數(shù)(個(gè))，n為對(duì)照組蟲數(shù)(個(gè))。

1.2.3 藥物對(duì)多子小瓜蟲包囊的體外殺蟲試驗(yàn)

根據(jù)藥物對(duì)掠食體的殺滅質(zhì)量濃度范圍配制不同，并進(jìn)行殺蟲預(yù)試驗(yàn)，初步確定藥物對(duì)包囊的殺蟲質(zhì)量濃度范圍，設(shè)定3種化合物的使用質(zhì)量濃度為10、20、30、40 mg/L。吸取150 μL的藥物于24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中。收集多子小瓜蟲包囊，并放置在燒杯中進(jìn)行稀釋，使其密度約為60個(gè)/μL，待藥物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿后于每個(gè)藥物孔中加入0.5 μL的蟲體，并放置于22 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20～36 h后，統(tǒng)計(jì)各藥物質(zhì)量濃度組的包囊死亡數(shù)量和孵化的幼蟲數(shù)量。試驗(yàn)設(shè)置一個(gè)空白藥物對(duì)照組和一個(gè)二甲基亞砜對(duì)照組(前期試驗(yàn)表明藥物中所添加的最高含量二甲基亞砜對(duì)多子小瓜蟲掠食體沒有毒性)。每個(gè)藥物質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行。

1.3 2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對(duì)翹嘴紅鲌的急性毒性試驗(yàn)

因化合物1(2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈)對(duì)多子小瓜蟲的體外殺蟲效果最強(qiáng)，故而研究其對(duì)翹嘴紅鲌的安全性。急性毒性試驗(yàn)按照文獻(xiàn)[14-15]的方法進(jìn)行，試驗(yàn)魚暫養(yǎng)7 d后先進(jìn)行毒性預(yù)試驗(yàn)，初步確定藥物的毒性試驗(yàn)質(zhì)量濃度，并按等對(duì)數(shù)間距設(shè)計(jì)7個(gè)質(zhì)量濃度：81.00、72.25、64.00、56.25、49.00、42.25、36.00 mg/L，以下不添加藥物為對(duì)照組。試驗(yàn)控制水溫(25±1) ℃，試驗(yàn)期間不投飼，及時(shí)撈出死魚，每個(gè)藥物質(zhì)量濃度試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

根據(jù)12、24、48、96 h平均死亡率，利用直線內(nèi)插法求出半致死質(zhì)量濃度(LD50)，再計(jì)算安全質(zhì)量濃度(SC)：

SC=(24 h LD50×0.3)/(24 h LD50/48 h LD50)3

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 16.0處理藥效數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)上述合成的3種化合物進(jìn)行質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等波譜技術(shù)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)而確定化合物合成成功。

化合物1：

電噴霧離子源質(zhì)譜:m/z—148.5 [M-CN]+；UV(MeOH)—λmax211 (4.42) nm，244(3.91) nm； IR:υmax(KBr, cm-1)—2220(w, C≡N)，1145(s, C-N)。核磁共振氫譜(CD3Cl, TMS)δ: 6.24(1H, d-like,J=8.5 Hz, H-1′), 7.357(7H, m), 5.67(1H, s, H-1), 3.34(1H, td,J=12.0, 4.0 Hz, H-3a), 3.53(1H, dd,J=12.0, 6.5 Hz, H-3b), 3.12(1H, ddd,J=15.8 12.3, 6.0 Hz, H-4a), 2.67(1H, br dd,J=15.8, 2.5 Hz, H-4b)。核磁共振碳譜(CD3Cl)δ: 144.3(C-1′), 115.6 (C≡N), 52.5 (C-1), 46.3 (C-3), 28.8(C-4), 133.2(C-5), 126.8 (C-6), 131.2 (C-7), 126.4 (C-8), 113.7(C-8a)。確定該化合物為2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈。

化合物2：

電噴霧離子源質(zhì)譜:m/z—163.8 [M-CN]+；UV(MeOH)—λmax211(4.83) nm，250(4.41) nm；IR:υmax(KBr, cm-1)—2225(w, C≡N)，1152(s, C-N)。核磁共振氫譜 (CD3Cl, TMS)δ: 7.23～7.33(5H, m), 6.71(3H, m), 5.54(1H, s, H-1), 3.69(1H, m, H-3a), 3.49 (1H, m, H-3b), 3.23(1H, ddd,J=16.0, 11.2, 6.0 Hz, H-4a), 2.88 (1H, dt-like,J=6.0, 4.2 Hz, H-4b)。核磁共振碳譜(CD3Cl)δ: 152.4 (C-1′), 149.8 (C-2′), 117.3(C≡N), 52.3(C-1), 44.1(C-3), 28.6 (C-4), 131.4 (C-5), 125.3 (C-6), 133.8 (C-7), 127.1 (C-8), 114.2(C-8a)。確定該化合物為2-乙胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈。

化合物3：

電噴霧離子源質(zhì)譜:m/z—176.7 [M-CN]+；UV (MeOH)—λmax251 (4.61) nm；IR:υmax(KBr, cm-1)—2225 (w, C≡N)，1148(s, C-N)；核磁共振氫譜 (CD3Cl, TMS)δ:7.29 (6H,m), 6.99 (2H, m), 5.47(1H, s, H-1), 3.71 (1H, m, H-3a), 3.48 (1H, m, H-3b), 3.16 (1H, m, H-4a), 2.94(1H, dd,J=6.5, 3.0 Hz, H-4b)；核磁共振碳譜(CD3Cl) δ: 147.0(C-1′), 128.7 (C-2′), 130.5 (C-3′), 117.5 (C≡N), 52.8 (C-1), 45.2 (C-3), 29.7 (C-4), 132.3 (C-5), 126.1 (C-6), 134.2 (C-7), 126.8 (C-8), 113.9 (C-8a)。確定該化合物為2-異丙基胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈。

2.2 N-取代四氫異喹啉衍生物對(duì)多子小瓜蟲掠食體的殺滅作用

合成的3種化合物在10～31 mg/L內(nèi)對(duì)多子小瓜蟲掠食體均具有一定的殺滅作用(圖2)。而殺蟲效果最好的為化合物1(2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈)，其質(zhì)量濃度為20.0 mg/L時(shí)，在4 h即可殺滅100%幼蟲，其4 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度為11.6 mg/L，其次是化合物2 (2-乙胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈)，其質(zhì)量濃度為24.0 mg/L時(shí)殺滅率為100%，其4 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度為 15.1 mg/L。殺蟲效果最差的為化合物3 (2-異丙基胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈)，其質(zhì)量濃度為31.0 mg /L時(shí)殺滅率為100%，其4 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度為18.2 mg/L。

圖2 化合物1～3對(duì)多子小瓜蟲掠食體的殺滅作用(4 h)Fig.2 Anti-parasitic efficacy of compounds 1—3 against I. multifiliis theronts in 4 h exposure

體外殺蟲試驗(yàn)結(jié)果還顯示，3種N-取代四氫異喹啉衍生物對(duì)多子小瓜蟲掠食體具有一定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞作用，多子小瓜蟲掠食體在接觸藥物4 h后，其表面纖毛不可見，細(xì)胞縮小，部分細(xì)胞破碎胞質(zhì)流出。而對(duì)照組結(jié)構(gòu)完好，纖毛運(yùn)動(dòng)正常，胞內(nèi)器官明顯，蟲體運(yùn)動(dòng)及活力正常(圖3)。

圖3 異喹啉衍生物作用多子小瓜蟲掠食體后的顯微結(jié)構(gòu)(20×)Fig.3 Microstructures of I. multifiliis theronts treated with etrahydroisoquinoline derivatives (20×)a.藥物作用4 h后; b.正常多子小瓜蟲掠食體.a.theronts treated with drug for 4 h; b.normal theronts.

2.3 N-取代四氫異喹啉衍生物對(duì)多子小瓜蟲包囊體的殺滅作用

3種N-取代四氫異喹啉衍生物對(duì)多子小瓜蟲包囊的殺滅作用見表1。合成的3種化合物在所測(cè)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)多子小瓜蟲的包囊均具有殺滅或抑制作用。殺蟲效果最好的為化合物1，其質(zhì)量濃度為40.0 mg/L時(shí)，在6 h即可殺滅100%包囊，其次是化合物2，其質(zhì)量濃度為40.0 mg/L時(shí)殺滅率為70.0%。殺蟲效果最差的為化合物3，其質(zhì)量濃度為40.0 mg/L時(shí)殺滅率為63.3%。由此可知，隨著N-取代基團(tuán)碳鏈的延長(zhǎng)其殺蟲效果不斷降低。

表1 化合物1～3對(duì)多子小瓜蟲包囊的成活和孵化影響(6 h)Tab.1 The survival and hatching of I. multifiliis tomonts exposed to compounds 1—3 for 6 h

2.4 2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對(duì)翹嘴紅鲌的急性毒性試驗(yàn)

2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對(duì)翹嘴紅鲌的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表2，由直線內(nèi)插法計(jì)算可得，2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對(duì)翹嘴紅鲌的24 h的半致死質(zhì)量濃度為66.57 mg/L，48 h的半致死質(zhì)量濃度為62.78 mg/L，96 h的半致死質(zhì)量濃度為51.0 mg/L。根據(jù)公式計(jì)算可得，其安全質(zhì)量濃度為16.75 mg/L。

表2 2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對(duì)翹嘴紅鲌的急性毒性Tab.2 The acute toxicity of 2-methylamino-1,2,3,4-tetrahydrois-oquinoline-formonitrile to topmouth culter E. ilishaeformis

3 討 論

3.1 異喹啉衍生物的殺蟲構(gòu)效關(guān)系

異喹啉及異喹啉的衍生物是一類重要的醫(yī)藥化工中間體，它被廣泛應(yīng)用于各種重要醫(yī)用藥物。姚嘉赟等[16-18]已獲得多種具有殺指環(huán)蟲和多子小瓜蟲的異喹啉類生物堿。分析各類異喹啉類生物堿的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，絕大部分該類生物堿均存在異喹啉或者異喹啉衍生物的基本框架結(jié)構(gòu)。因此，異喹啉這個(gè)基本框架極有可能是殺蟲的主要藥效基團(tuán)，故而筆者以苯乙醇為起始原料合成了3種異喹啉類衍生物，體外殺蟲藥效結(jié)果也顯示了預(yù)期的設(shè)想，這從側(cè)面證實(shí)了異喹啉有可能是殺蟲的主要藥效基團(tuán)。同時(shí)，體外殺蟲試驗(yàn)結(jié)果還顯示，隨著N-取代基團(tuán)碳鏈的延長(zhǎng)其殺蟲效果明顯降低。Wen等[19]研究也表明，側(cè)鏈糖基的數(shù)量影響著殺多子小瓜蟲的藥效結(jié)果，糖基數(shù)量越多其殺蟲效果越差。

3.2 異喹啉衍生物的殺蟲活性

體外試驗(yàn)結(jié)果表明，3種異喹啉衍生物可造成多子小瓜蟲蟲體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞、纖毛脫落以及胞質(zhì)外流，這與孔雀石綠作用于多子小瓜蟲的現(xiàn)象基本相同[20]。近期的研究結(jié)果表明，異喹啉類生物堿對(duì)細(xì)胞毒性的作用位點(diǎn)主要是細(xì)胞的線粒體，它可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡，其對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用主要是通過線粒體的多誘導(dǎo)凋亡途徑實(shí)現(xiàn)[21]。線粒體在調(diào)控細(xì)胞凋亡以及凋亡和壞死性細(xì)胞死亡造成的功能性損失方面起著重要的作用[22]。這可能是本研究中3種化合物殺蟲的作用機(jī)理之一。蘆程等[23]研究表明，異喹啉生物堿血根堿對(duì)指環(huán)蟲的殺蟲機(jī)理是其對(duì)蟲體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)造成損害，進(jìn)而導(dǎo)致蟲體體表結(jié)構(gòu)損壞，合胞體、分泌顆粒、線粒體減少，體壁頂部質(zhì)膜損壞，進(jìn)而造成基板致密結(jié)構(gòu)變得稀疏，形成許多孔洞，進(jìn)而造成蟲體破裂。而本試驗(yàn)中，異喹啉衍生物對(duì)多子小瓜蟲掠食體用藥6 h后造成其胞質(zhì)外流、細(xì)胞破碎，其作用機(jī)理也可能是改變了蟲體的抗氧化系統(tǒng)，但其具體的作用位點(diǎn)、作用模式和作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，筆者以苯乙醇為起始化合物合成了3個(gè)N-取代四氫異喹啉類化合物，這3種化合物對(duì)多子小瓜蟲幼蟲和包囊均有較好的殺滅效果，且隨著N-取代基團(tuán)碳鏈的延長(zhǎng)其殺蟲效果不斷降低，這可為將來該類殺蟲化合物的合成提供一定的借鑒作用。

4 結(jié) 論

以苯乙醇為原料合成3種N-取代四氫異喹啉衍生物，其中，2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈殺多子小瓜蟲活性最強(qiáng),且該化合物對(duì)魚類的毒性較低，具有較好的開發(fā)潛力。