王小莉，楊浩宇，邱 禹，崔 潔，阮立慧，李 亮*

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室 安徽省感染與免疫重點實驗室，安徽 蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院 顯微形態(tài)實驗中心，安徽 蚌埠 233030；3.蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

血吸蟲病(schistosomiasis)是一種嚴重危害健康的人獸共患寄生蟲病，感染人數(shù)達3.95-5.97億，超過7億人(多數(shù)為兒童)的健康受到該病威脅[1-2]。我國流行的是日本血吸蟲病，經(jīng)過70多年的努力，截至2019年底，全國晚期血吸蟲病人30 170例[3]。目前藥物化療仍是我國防控血吸蟲病的主要手段[4]，因出色的療效、廣譜的適用性、毒性低等優(yōu)點，吡喹酮(praziquantel，PZQ)被WHO推薦為抗血吸蟲病的首選藥物[5]。雖然PZQ對各種類型血吸蟲成蟲階段均有良好的殺傷效果，但對童蟲階段作用弱[6-7]。此外，隨著長期大范圍的使用，PZQ治療不敏感以及在實驗室通過亞致死劑量誘導(dǎo)出耐藥性蟲體屢見報道[8-10]，因此尋找替代或候選藥物治療血吸蟲病亟待解決。

血吸蟲細胞內(nèi)鈣離子平衡由多種組分共同調(diào)控，如電壓門控鈣離子通道(voltage-gated calcium channels，VGCC)、配體門控鈣通道、第二信使門控鈣通道、鈣釋放通道等[11-13]。而一些鈣離子通道拮抗劑被證實具有抗血吸蟲活性[14-15]。根據(jù)PZQ作用后血吸蟲有痙攣性麻痹、皮層損傷等現(xiàn)象，多項研究認為PZQ殺傷作用與干擾蟲體內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)[16]，借助RNA干擾技術(shù)，進一步揭示VGCC可能是PZQ的作用靶點[17]。既往報道顯示VGCC阻斷劑硝苯地平對曼氏血吸蟲[18]、艾美耳球蟲[19]具有抑制作用，但對于日本血吸蟲具有何種作用尚不清楚。因此，本研究擬利用VGCC阻斷劑硝苯地平，觀察其體外對日本血吸蟲殺傷作用；通過硝苯地平和PZQ聯(lián)合，觀察硝苯地平對PZQ殺傷日本血吸蟲作用的影響，同時利用掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察蟲體超微變化，進一步探討硝苯地平殺傷日本血吸蟲的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物和蟲株

BALB/c小鼠，雌性，18-25 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司[SCXK(京)2016-0010]，(22±2)℃常溫環(huán)境飼養(yǎng)。陽性釘螺來自中國CDC寄生蟲病預(yù)防控制所，蟲株為中國大陸株。

1.1.2主要試劑與儀器

PZQ片劑(沈陽紅旗制藥有限公司)。

硝苯地平(Sigma公司)；青霉素-鏈霉素溶液(碧云天生物有限公司)；DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)；二甲基亞砜(Fluka公司)；叔丁醇、戊二醛、氯化鈉、二水合檸檬酸三鈉(麥克林生化科技有限公司)；

掃描電鏡S4700(Hitachi公司)；倒置顯微鏡(MZ 12.5，Leica公司)。

PZQ片劑、硝苯地平均溶于DMSO中配制成工作液。

1.2 方法

1.2.1動物模型

按常規(guī)釘螺逸尾蚴方法獲得日本血吸蟲尾蚴。挑取尾蚴滴于蓋玻片，貼于小鼠濕潤的腹部皮膚，尾蚴可經(jīng)皮侵入小鼠體內(nèi)。每只小鼠感染60條尾蚴。

1.2.2成蟲收集

感染28 d后，采用肝門靜脈灌注法，檸檬酸鈉生理鹽水液體(0.85%氯化鈉-1.5%二水合檸檬酸三鈉)灌注，蟲體隨液體沖至80孔/25.4 mm不銹鋼篩網(wǎng)，DMEM培養(yǎng)基沖洗濾網(wǎng)，收集液體。根據(jù)活力評分標準[19-20]，于倒置顯微鏡下挑取活力正常的雄蟲，每5條/孔蟲體培養(yǎng)于6孔板，加入3 mL 完全DMEM(含10%胎牛血清-1%青霉素/鏈霉素溶液)共培養(yǎng)。

1.2.3硝苯地平對日本血吸蟲雄蟲的殺傷作用

加入硝苯地平，使其終濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL和1.0 μg/mL，設(shè)陰性對照組(加0.1% DMSO)，每組5個復(fù)孔。空白組(不加任何藥物)作為整個實驗監(jiān)控。加藥后置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，換液，加入完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，于倒置顯微鏡下觀察蟲體活力情況。參照文獻[21]，依據(jù)蟲體運動度、透明度、顏色等，活力評分標準為0-3分，3分：蟲體呈透明狀、運動活波、體態(tài)柔和；2分：蟲體呈半透明狀、活動差、體態(tài)稍僵硬；1分：蟲體部分呈不透明，僅頭部或尾部輕微活動、體態(tài)僵硬；0分：整個蟲體收縮呈白色，連續(xù)觀察30 s沒有運動，定義為“死亡”。統(tǒng)計每組蟲體活力總分值，計算每組蟲體活力平均值為Σ(每組蟲體活力總分值) /每組蟲體數(shù)。

1.2.4硝苯地平與PZQ聯(lián)合對雄蟲的殺傷作用

設(shè)4組，分別為A組(加0.1%DMSO)、B組(14 μmol/L PZQ)、C組(1.0 μg/mL硝苯地平)、D組(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)，每組5個復(fù)孔。D組先加入硝苯地平，孵育2 h后再加入PZQ。置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，換液，加入完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，鏡檢蟲體活力情況。

蟲體活力判斷標準及統(tǒng)計同上。觀察結(jié)束，各實驗組蟲體拍照，記錄大體形態(tài)。

1.2.5掃描電鏡觀察

培養(yǎng)結(jié)束后收集蟲體，5%戊二醛固定12 h；經(jīng)0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，1%餓酸固定液染色1 h，30%-100%叔丁醇梯度脫水。將蟲體真空干燥，置于掃描電鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 硝苯地平體外對日本血吸蟲雄蟲的殺傷作用

不同濃度硝苯地平作用下日本血吸蟲雄蟲活力值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=76.06，P<0.05)。與對照組蟲體活力值(2.96±0.09)比較，0.05、0.10 μg/mL 硝苯地平組蟲體活力值降低，為(2.88±0.18)、(2.84±0.17)，差異(均P>0.05)均無統(tǒng)計學(xué)意義。當硝苯地平終濃度為0.20、0.50、1.00 μg/mL時，雄蟲活力值分別為(2.24±0.17)、(1.68±0.18)和(1.56±0.17)，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)(見圖1)。相關(guān)性分析表明，在0.05 - 1.00 μg/mL濃度區(qū)間，蟲體活力值與硝苯地平濃度(r=-0.880，P<0.01)之間呈負相關(guān)，即體外培養(yǎng)的日本血吸蟲雄蟲活力值隨著硝苯地平濃度升高而降低。與對照組(加0.1%DMSO)比較，***P<0.001。

圖1 硝苯地平體外對日本血吸蟲雄蟲的殺傷作用

2.2 硝苯地平與PZQ聯(lián)合對日本血吸蟲雄蟲的殺傷作用

實驗結(jié)果顯示，硝苯地平、PZQ作用下日本血吸蟲雄蟲活力值(F=378.16，P<0.01)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。B、C、D組血吸蟲雄蟲活力值分別為：(0.20±0.14)、(1.56±0.17)、(1.32±0.11)，與A組(2.96±0.09)比較，差異(均P<0.01)有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D組蟲體活力值明顯高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；D組與C組比較，蟲體活力值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 硝苯地平和PZQ聯(lián)合體外對日本血吸蟲雄蟲的殺傷效應(yīng)

圖2中：與對照組比較，**P<0.01。A對照組(加0.1%DMSO)；B組(14 μmol/L PZQ)；C組(1.0 μg/mL硝苯地平)；D組(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)。

2.3 日本血吸蟲雄蟲的形態(tài)觀察

2.3.1大體形態(tài)變化

在鏡下可見A組雄蟲體態(tài)柔和，伸縮自如，彎曲自然，呈透明狀，借助吸盤吸附在皿底。B組蟲體腫脹，吸盤失去吸附能力，呈白色不透明、無伸縮運動，整個蟲體彎曲或蜷縮呈逗點狀。C組蟲體腫脹，吸盤吸附力下降，運動緩慢；呈白色半透明狀，尾部向腹部卷曲。D組螺旋狀蟲體的頭部輕微運動，逐漸恢復(fù)運動，伸展體部，呈白色半透明狀(見圖3)。

圖3 硝苯地平和PZQ作用后日本血吸蟲雄蟲形態(tài)

圖3中：A組(對照組，0.1% DMSO)；B組(14 μmol/L PZQ)；C組(1.0 μg/mL硝苯地平)；D組(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)。標尺為1000 μm。

2.3.2蟲體體表超微結(jié)構(gòu)變化

掃描電鏡觀察可見正常蟲體(A組)體表均勻分布海綿狀結(jié)構(gòu)，由細胞質(zhì)突出形成的褶嵴和深陷的凹窩構(gòu)成，其上分布有隆起圓凸形感受器；B、C、D組蟲體體表損傷明顯，體表海綿狀結(jié)構(gòu)的褶嵴和凹窩排列紊亂、融合、變窄或消失，感受器乳突變形、陷沒或破潰，未見皮層剝落及皮下肌層暴露(見圖4)。此外，B組蟲體皮層褶嵴皺縮而呈裂縫狀，因滲出出現(xiàn)水泡或大面積融合呈腐蝕狀。C組可見褶嵴與相鄰凹窩大面積融合，間插坑狀缺損。D組蟲體皮層因褶嵴皺縮和水腫交錯呈裂縫狀，伴有孔狀缺損。

圖4 硝苯地平和PZQ作用后日本血吸蟲雄蟲超微結(jié)構(gòu)

圖4中：A組(對照組，0.1% DMSO)；B組(14 μmol/L PZQ)；C組(1.0 μg/mL硝苯地平)；D組(1.0 μg/mL硝苯地平+14 μmol/L PZQ)。

3 結(jié)論

在血吸蟲的多項生理活動中，VGCC是必不可少的參與者，如細胞內(nèi)鈣離子平衡、肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、基因表達等[22]。VGCC是由多個亞基構(gòu)成的異源多聚體跨膜蛋白復(fù)合物，包括形成孔狀結(jié)構(gòu)的主要亞基α1和輔助亞基α2、β、δ、γ。在曼氏血吸蟲cDNA序列中，其中1個α1亞基(SmCav1)與脊椎動物的高壓激活鈣離子通道(high voltage-activated，HVA)L-型的α1亞基相似達50%-55%[23]。硝苯地平是一種高效的L型VGCC拮抗劑，可通過變構(gòu)結(jié)合在α1孔區(qū)結(jié)構(gòu)域的不同位置來調(diào)節(jié)通道[24]?；谙醣降仄交钚浴⒀x與脊椎動物VGCC的相似性，因此本研究以硝苯地平作為VGCC拮抗劑。結(jié)果顯示隨著硝苯地平濃度升高(≥0.20 μg/mL)，雄蟲活力值明顯低于對照組，以1.0 μg/mL硝苯地平作用下蟲體活力值最低，表明一定濃度的硝苯地平體外對日本血吸蟲雄蟲具有殺傷作用。這與Silva-Moraes等采用硝苯地平可殺傷曼氏血吸蟲童蟲和成蟲的研究結(jié)果[18]可以相互印證。結(jié)合鏡下觀察1.0 μg/mL硝苯地平組蟲體痙攣、卷曲現(xiàn)象，考慮因硝苯地平阻斷了蟲體VGCC，消除了細胞外鈣離子內(nèi)流，使細胞內(nèi)鈣離子存儲釋放被耗盡而致蟲體活動能力下降或死亡。

日本血吸蟲體最外層結(jié)構(gòu)為體壁，體壁皮層具有重要的保護作用，皮層結(jié)構(gòu)的不完整可使蟲體因滲透壓力、營養(yǎng)物質(zhì)交換等失衡而死亡，因而皮層變化也往往被用來評估藥物的抗血吸蟲活性[25-26]。研究證實PZQ的敏感位點是在血吸蟲的皮層和肌纖維膜，在本研究的超微變化中PZQ作用后蟲體皮層損傷明顯，與既往報道相一致[17]。硝苯地平作用后蟲體可見皮層的海綿狀結(jié)構(gòu)紊亂、融合、缺損，這些變化表明蟲體細胞膜對硝苯地平敏感，皮層的損傷會破壞蟲體的防御系統(tǒng)，表面暴露的抗原使其容易被宿主的免疫系統(tǒng)識別而被殺傷[27]。經(jīng)過硝苯地平預(yù)孵育后PZQ作用下蟲體活力值雖有所恢復(fù)，但蟲體皮層結(jié)構(gòu)仍可見損傷變化，提示了硝苯地平和PZQ 致皮層的損傷效應(yīng)并非藥物直接作用，可能是誘導(dǎo)蟲體細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致蟲體痙攣性收縮的繼發(fā)效應(yīng)，而VGCC參與了這種繼發(fā)效應(yīng)，因而PZQ殺傷血吸蟲作用可被VGCC阻斷劑硝苯地平所拮抗。

世界范圍內(nèi)PZQ 頻繁使用誘導(dǎo)血吸蟲產(chǎn)生抗藥性的問題已引起了廣泛關(guān)注，而PZQ殺傷作用機制的不明確限制了PZQ衍生物類新藥的研發(fā)。研究顯示多種基于藥效基團設(shè)計新藥或針對高通量篩選出的靶點藥物尚無法比擬PZQ殺傷效果[28-30]，因此，尋找抗血吸蟲候選藥物或新靶點仍道路漫長。本研究表明硝苯地平在體外對日本血吸蟲成蟲具有一定殺傷作用，其與PZQ聯(lián)合用藥可降低PZQ殺傷日本血吸蟲效果，證實了VGCC參與了PZQ抗血吸蟲作用，支持了發(fā)展VGCC作為抗血吸蟲藥物靶點的潛在前景[31]。如何通過調(diào)整體內(nèi)用藥劑量、時間、病程階段等給藥方案，在利用硝苯地平提高殺蟲效果的同時，降低其對PZQ的抑制影響，將是應(yīng)用鈣離子通道阻斷劑治療血吸蟲病研究的一個重要問題，有待于進一步探索。