康亞男 劉 濤張小波柳 珊吳雅清 趙玉龍

（1瑞普 （保定）生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000；2天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308；3河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000；4廊坊市加一農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，河北廊坊 065000）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起豬的一種高度接觸性傳染病，臨床以高熱、皮膚和內(nèi)臟廣泛性出血、神經(jīng)癥狀、腹瀉、死亡為主要特征，自2018年8月以來，我國(guó)境內(nèi)非洲豬瘟疫情持續(xù)擴(kuò)散蔓延，給養(yǎng)豬企業(yè)帶來很大影響[1]。非洲豬瘟病毒目前共有24個(gè)基因型，除基因Ⅰ型和基因Ⅱ型外，其余基因型只出現(xiàn)在非洲大陸，我國(guó)流行的是非洲豬瘟病毒基因Ⅱ型、血清8群，與俄羅斯和東歐國(guó)家的流行毒株屬于同一分支[2,3]。我國(guó)是生豬養(yǎng)殖和豬肉產(chǎn)品消費(fèi)大國(guó)，生豬的養(yǎng)殖量和存欄量均占全球總量一半以上，豬肉消費(fèi)占總?cè)忸愊M(fèi)的60%以上[4]，非洲豬瘟疫情的發(fā)生，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失，在缺乏有效的ASF疫苗或治療手段的情況下，如何控制和凈化非洲豬瘟病毒，成為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重中之重。

1 非洲豬瘟病毒概述

非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種大型的、復(fù)雜的DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是唯一由節(jié)肢動(dòng)物（軟蜱）傳播的雙鏈DNA病毒。該病毒是一個(gè)復(fù)雜的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，包括許多同軸心結(jié)構(gòu)，外部有六角形膜，病毒粒子平均直徑約200 nm。ASFV的基因組與痘病毒相似，不同毒株基因組長(zhǎng)度在170～190 kb之間，包含151～167個(gè)開放閱讀框，病毒基因組包含約125 kb的保守中心區(qū)域和2個(gè)可變末端，即左側(cè)可變區(qū)（38～47 kb）和右側(cè)可變區(qū)（13～16 kb），編碼5個(gè)多基因家族（MGFs），MGF片段的缺失和插入是病毒基因組大小變化的原因所在[5]。2018年Alejo等[6]通過ASFV蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出68種病毒蛋白；隨后專家學(xué)者相繼研究推測(cè)出3種核心多聚蛋白（pp220、pp62和p10）、7種內(nèi)囊膜蛋白的功能和作用機(jī)制，構(gòu)成ASFV粒子的主要外衣殼蛋白（或外囊膜蛋白）有p72、p54、p30、P12、CD2v等。其中p72、p54、p30、p12等蛋白具有良好的抗原性，病毒衣殼的p72蛋白具有高度的保守性主要作為血清學(xué)診斷靶標(biāo)，但目前這些蛋白中尚未發(fā)現(xiàn)存在足夠保護(hù)作用的蛋白[7]。ASFV耐低溫，但對(duì)高溫敏感，不同溫度條件下存活時(shí)間不同，56℃可存活70 min，60℃可存活20 min，25～37℃可存活數(shù)周，在4℃條件下可以存活1年以上，在冷凍豬肉中可存活數(shù)年。對(duì)含氯消毒劑、含碘消毒劑、強(qiáng)堿類消毒劑和醛類消毒劑等敏感[8]。

2 我國(guó)非洲豬瘟疫情發(fā)生的現(xiàn)狀

2.1 非洲豬瘟在我國(guó)的流行現(xiàn)狀

隨著生物安全防控水平的提升，進(jìn)入2020年，非洲豬瘟疫情在我國(guó)豬場(chǎng)的發(fā)生率明顯降低，但高發(fā)群體、高發(fā)區(qū)域、高發(fā)時(shí)間較2019年有了明顯變化。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部數(shù)據(jù)顯示，2020年中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心共計(jì)報(bào)告非洲豬瘟疫情19起，其中：家豬疫情18起，且16起與違規(guī)調(diào)運(yùn)有關(guān)；野豬疫情1起，系2020年3月3日于湖北省神農(nóng)架林區(qū)陽日鎮(zhèn)、松柏鎮(zhèn)發(fā)生，共發(fā)現(xiàn)死亡野豬7頭（見表1）。

表1 2020年我國(guó)非洲豬瘟疫情匯總表

2.2 非洲豬瘟疫苗研發(fā)

2.2.1 非洲豬瘟疫苗研發(fā)進(jìn)展

在以往的40多年里，科研人員對(duì)非洲豬瘟病毒的滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒活載體疫苗、減毒活疫苗以及基因缺失疫苗等進(jìn)行了相關(guān)的研究。在非洲豬瘟疫苗研究中，發(fā)現(xiàn)體液免疫只能對(duì)生豬產(chǎn)生部分保護(hù)，起主要作用的是細(xì)胞免疫。Blome等[9]最近研究證實(shí)非洲豬瘟病毒的滅活疫苗輔以新型的佐劑在非洲豬瘟病毒攻毒的動(dòng)物上不能產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。弱毒疫苗可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈且持久的免疫反應(yīng)，使用無毒力自然弱毒的Ⅰ型非洲豬瘟病毒OUR T88/3分離株免疫豬只，結(jié)果豬只能夠?qū)υ摶蛐拖虏煌局甑墓ザ井a(chǎn)生免疫作用，并且對(duì)非洲豬瘟病毒其他基因型的毒株感染產(chǎn)生交叉免疫作用。非洲豬瘟病毒的SP148R基因缺失型突變株是非洲豬瘟病毒疫苗的弱毒株疫苗，在豬只免疫攻毒后能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高水平的保護(hù)力。也有研究報(bào)道通過敲除涉及ASFV復(fù)制、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)或先天免疫應(yīng)答的基因可以構(gòu)建低毒力的基因缺失毒株疫苗，但疫苗候選株的有效性、安全性和不良反應(yīng)尚待評(píng)估[10-12]。

2.2.2 我國(guó)對(duì)非洲豬瘟病毒基因缺失活疫苗的研究進(jìn)展

2020年3月中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所自主研發(fā)的非洲豬瘟病毒基因缺失活疫苗（HLJ/18-7GD）獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品臨床試驗(yàn)批件，批準(zhǔn)其在黑龍江、河南和新疆等地的3個(gè)養(yǎng)殖基地開展試驗(yàn)，截止2020年6月，非洲豬瘟疫苗環(huán)境釋放試驗(yàn)順利開展，免疫仔豬、免疫母豬及免疫母豬產(chǎn)仔情況正常，無疫苗毒排放，免疫仔豬生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無不良癥狀、無明顯病理變化，且安全性良好[13]。2020年9月非洲豬瘟病毒弱毒活疫苗（HLJ/18-7GD株）進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

2.2.3 非洲豬瘟病毒檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)

隨著非洲豬瘟疫情在我國(guó)的點(diǎn)狀散發(fā)，國(guó)內(nèi)研究機(jī)構(gòu)對(duì)非洲豬瘟病毒的檢測(cè)方法手段進(jìn)行了大量的研究，包括中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心進(jìn)行的非洲豬瘟病毒國(guó)家核酸參考材料的建立與應(yīng)用，建立了非洲豬瘟病毒B646L基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；官方公布數(shù)據(jù)顯示，截至2021年1月，獲得新獸藥證書的有2種非洲豬瘟病毒熒光PCR試劑盒和1個(gè)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒；獲得獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)的有6種非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)試劑盒，包括上述3項(xiàng)新獸藥注冊(cè)證書產(chǎn)品、3項(xiàng)直接核發(fā)獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)的改良型獸醫(yī)診斷制品。

2020年12月14日國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)正式發(fā)布新版《非洲豬瘟診斷技術(shù)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18648-2020）中，規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)有9種，即普通PCR法、熒光PCR法、熒光RAA法、高敏熒光免疫分析法、夾心ELISA抗原檢測(cè)法、間接ELISA抗體檢測(cè)法、阻斷ELISA抗體檢測(cè)法、夾心ELISA抗體檢測(cè)法和間接免疫熒光法。

根據(jù)《高致病性動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理審批辦法》農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家外來動(dòng)物疫病診斷中心實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家動(dòng)物疫病防控高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室等8家ABSL-3實(shí)驗(yàn)室可以從事非洲豬瘟病毒的分離、鑒定、活病毒培養(yǎng)、動(dòng)物接種試驗(yàn)等相關(guān)研究，非洲豬瘟病毒的神秘面紗隨著研究的深入也將逐漸褪去，實(shí)驗(yàn)室研究將為我國(guó)非洲豬瘟疫情的防控提供有效的保障。

3 非洲豬瘟疫情的防控措施

3.1 生物安全防控

非洲豬瘟的防控措施主要包括以下4個(gè)方面：一是要求設(shè)立物理屏障（如養(yǎng)殖場(chǎng)隔離綠化帶)，凈化飼養(yǎng)場(chǎng)周圍空氣，預(yù)防飛禽、病蟲害與場(chǎng)內(nèi)物品接觸；二是控制家豬循環(huán)中的安全隱患，包括污染的豬肉制品、泔水、污染的飼料用具、污染的飲水及設(shè)備、污染的人員工具等，做好豬場(chǎng)生產(chǎn)區(qū)的人員、物資、工具等的消毒工作；三是工作人員進(jìn)出飼養(yǎng)場(chǎng)所應(yīng)遵守嚴(yán)格的衛(wèi)生管理制度，接受消毒浴、穿專業(yè)工作服；四是規(guī)定生豬運(yùn)輸車輛卸載后進(jìn)行清洗、消毒，加強(qiáng)生豬調(diào)運(yùn)管理，實(shí)施必要的隔離措施后才能混群飼養(yǎng)[14,15]。

3.2 加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部加快推進(jìn)非洲豬瘟病毒疫苗的研制工作，同時(shí)持續(xù)強(qiáng)化非洲豬瘟的防控措施，進(jìn)一步健全動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)預(yù)警體系，各地區(qū)的獸醫(yī)、海關(guān)、出入境檢疫檢驗(yàn)及邊防部門等協(xié)同工作，加強(qiáng)信息共享、抓好常態(tài)防控工作，及時(shí)發(fā)現(xiàn)及早處理。貫徹落實(shí)引種與種質(zhì)資源管理，堅(jiān)決不允許從高風(fēng)險(xiǎn)或風(fēng)險(xiǎn)不確定的區(qū)域引入種豬、凍精以及胚胎等生物材料。相關(guān)從業(yè)工作人員，應(yīng)加強(qiáng)ASF相關(guān)知識(shí)及疫情應(yīng)急處置培訓(xùn)，包括非洲豬瘟發(fā)病豬的臨床癥狀、病豬的處置方式、防控策略、與古典豬瘟等疫病的鑒別診斷水平；提升面對(duì)ASF的處置能力和知識(shí)水平，進(jìn)而更加有效地控制非洲豬瘟疫情的傳播[16,17]。

3.3 藥物預(yù)防策略

預(yù)防非洲豬瘟病毒的藥物按來源分為天然藥物、合成藥物、生物技術(shù)藥物3大類，其中天然藥物又分為植物性藥物、動(dòng)物性藥物、礦物性藥物、抗生素4類。中國(guó)是植物性藥物研究最古老、最傳統(tǒng)的國(guó)家。2018年6月，王卓亞等[18]在解析非洲豬瘟病毒DNA聚合酶X的晶體機(jī)構(gòu)基礎(chǔ)上，開展了以DNA聚合酶X為靶點(diǎn)的計(jì)算機(jī)虛擬藥物篩選項(xiàng)目，篩選出中國(guó)境內(nèi)分布潛在的具有抑制非洲豬瘟病毒的海洋與陸生天然生物，其中大部分來源于海洋生物；植物性藥物中對(duì)非洲豬瘟病毒直接起殺滅作用的有銀蟾散、刺五加、雙黃連、三黃抗菌保肝健脾方藥物等。迂斌等[19]研發(fā)了抗非洲豬瘟病毒藥物產(chǎn)品“康之源”，以刺五加、女貞子、越橘為主要成分，通過增強(qiáng)豬體的免疫力或雙向免疫調(diào)節(jié)，解除免疫抑制，提高機(jī)體抗病毒能力。此外，江西一家獸藥生產(chǎn)企業(yè)按照組方設(shè)計(jì)原則將銀環(huán)蛇毒、蟾酥、斑蝥素、黃芪等12種中藥材進(jìn)行組方，該組方藥物在切斷ASF病毒的復(fù)制和傳播能力上有著明顯的效果。

4 小結(jié)

非洲豬瘟現(xiàn)已進(jìn)入我國(guó)，常態(tài)化防疫、有效的快速診斷和構(gòu)建嚴(yán)密的生物安全體系是目前疾病防控的有效手段。利用基因敲除技術(shù)獲得的減毒活疫苗和弱毒活疫苗的研制正在進(jìn)行中，其中，疫苗的安全性、毒力返強(qiáng)、不良反應(yīng)、基因重組等問題是考核疫苗的重要因素。ASFV主要在髓系細(xì)胞中復(fù)制，如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和樹狀細(xì)胞等，開發(fā)適用于ASFV培養(yǎng)的細(xì)胞系也是亟待解決的問題，且ASFV基因組龐大，并存在免疫逃逸現(xiàn)象。當(dāng)前，ASFV的感染與免疫機(jī)制、主要蛋白結(jié)構(gòu)的功能、主要免疫原的識(shí)別與疫苗靶點(diǎn)是研究的熱點(diǎn)。針對(duì)以上存在的問題我國(guó)現(xiàn)已啟動(dòng)ASFV專項(xiàng)研究，包含重大基礎(chǔ)科學(xué)問題解決、各類疫苗研發(fā)、流行病學(xué)調(diào)研、高效專用消毒劑研制等。目前針對(duì)非洲豬瘟病毒的診斷，我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布了《非洲豬瘟診斷技術(shù)》（GB/T 18648-2020），為我國(guó)非洲豬瘟疫情的及時(shí)診斷及防控工作提供重要科技支撐，相信不久的將來非洲豬瘟病毒的科學(xué)有效防控乃至凈化終會(huì)實(shí)現(xiàn)。