葛海燕，匡 霞，周瑞君

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是我國居民特別是老年群體的常見疾病[1，2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，普通人群NAFLD發(fā)病率約為20%～30%，而T2DM人群中NAFLD發(fā)病率可達60%～80%[3，4]。NAFLD患者進展為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和肝纖維化還可導致肝硬化和肝細胞癌。NAFLD與T2DM 之間存在復雜的病理學相互作用，值得引起重視[5，6]。探討NAFLD和T2DM相關標志物對于早期診療和治療藥物的開發(fā)具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(micro RNA，miRNA)作為一種短序列小分子，廣泛參與NAFLD和T2DM的疾病發(fā)生、發(fā)展過程，但在NAFLD合并T2DM患者，它們的表達譜改變研究還較少，且存在一定的爭議。miRNA分子用于NAFLD合并T2DM患者的臨床診斷、病情和療效評估及預后判斷的價值還有待闡明[7，8]。本研究檢測了NAFLD合并T2DM患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b水平變化，以判斷其臨床意義，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年12月～2020年6月我院收治的T2DM患者46例，男性19例，女性27例；年齡39～65歲，平均年齡為(55.9±6.7)歲；NAFLD合并T2DM患者50例(輕度19例、中度17例和重度14例)，男性25例，女性25例；年齡28～67歲，平均年齡為(46.1±6.5)歲。NAFLD診斷符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[9]，無過量飲酒(或飲酒量折合乙醇男性<40 g/d，女性<20 g/d)。T2DM診斷符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[10]，空腹血糖≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L。排除標準：存在全身炎癥性疾病、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎或惡性腫瘤者；近2個月內(nèi)有服用降糖藥物史；妊娠期或哺乳期婦女；合并心、腦、腎等臟器功能嚴重不全者?；颊吆炇鹬橥鈺?，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2 外周血miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA檢測 無菌抽取外周靜脈血3 mL，離心，提取總RNA(日本TAKARA公司)，將RNA逆轉錄為cDNA，將樣品保存于-80℃冰箱。采用實時熒光定量RT-PCR法擴增miR-17、miR-20a和miR-20b目標片段，擴增反應體系為20μL，反應條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 28 s，35個循環(huán)完成后，72℃ 10 min。以β-action為內(nèi)參基因，在反應結束后，以2-ΔΔct法得出3指標的相對水平。引物由南京擎科生物公司合成，使用美國羅氏公司生產(chǎn)的Cobas Lightcycle480z熒光定量PCR儀。

1.3 血生化指標檢測 使用日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的AU2700型全自動生化分析儀檢測。

2 結果

2.1 兩組BMI和血脂指標比較 NAFLD合并T2DM患者BMI、血清TG、TC和LDL-C水平顯著高于T2DM患者(P<0.05)，而血清HDL-C水平顯著低于T2DM患者(P<0.05，表1)。

表1 兩組BMI和血脂指標比較

2.2 兩組血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平比較 NAFLD合并T2DM患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平顯著高于T2DM患者(P<0.05，表2)。

表2 兩組血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平比較

2.3 不同嚴重程度NAFLD患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平比較 重度組血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平顯著高于中度組或輕度組(P<0.05)，中度組血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平顯著高于輕度組(P<0.05，表3)。

表3 不同程度NAFLD患者血清miRNA水平比較

2.4 NAFLD合并T2DM的多因素Logistic回歸分析 結果顯示，BMI、LDL-C、miR-17、miR-20a和miR-20b是NAFLD合并T2DM的獨立危險因素(P<0.05，表4)。

表4 NAFLD合并T2DM的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清 miR-17、miR-20a、miR-20b診斷嚴重NAFLD的效能分析 經(jīng)ROC分析顯示，血清miR-17、miR-20a、miR-20b診斷嚴重NAFLD的AUC分別為0.75、0.74、0.70(P<0.05，表5，圖1)。

表5 各指標診斷嚴重NAFLD的效能

圖1 血清miRNA診斷嚴重NAFLD的ROC曲線

3 討論

相關研究發(fā)現(xiàn)NAFLD合并T2DM患者糖脂代謝失衡更為嚴重，全身炎癥水平較高，T2DM和NALFLD進展的傾向更為明顯，對其機制進行研究對于改善患者生存質(zhì)量，延長壽命具有重要的意義[11-15]。T2DM患者存在多種合并癥，僅依賴社區(qū)血糖監(jiān)測和降糖藥物治療難以避免并發(fā)癥的發(fā)生。NAFLD早期發(fā)病較為隱匿，對其確診依賴于組織病理學檢查，目前臨床上主要以影像學檢查、血清學檢查對其進行評估。

miRNA可抵抗核糖核酸酶的降解過程保持相對穩(wěn)定，因此循環(huán)血miRNA水平被報道對于多種疾病具有良好的診斷效能，還可用于多種疾病的病情和治療反應的評估，并對預后有一定的預測價值，是具有潛力的血液生物標志物[16，17]，但目前研究有關NAFLD患者miRNA譜變化存在一定的爭議。采用微陣列技術研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD合并T2DM患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平顯著升高[18]，與本研究結果一致。NAFLD合并T2DM患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平變化的臨床意義尚需進一步闡明。本研究比較了不同嚴重程度的NAFLD患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平的變化，結果顯示隨著NAFLD嚴重程度的加重，血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平也不斷升高，提示血清miR-17、miR-20a和miR-20b 可能參與了NAFLD患者發(fā)生T2DM的過程，還可能影響NAFLD患者的病情進展。

已有T2DM和NAFLD患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平變化的研究報道，體外研究發(fā)現(xiàn)，miR-17和miR-20a異位表達可以顯著抑制肝細胞Pknox1的表達，而miR-17和miR-20a過表達還可導致HepG2和L02細胞胰島素敏感性顯著提高并減少肝臟脂肪變性[19]。miR-17 可通過靶向調(diào)控CYP7A1的方式調(diào)控脂肪變性過程，降低HepG2細胞miR-17水平可加劇肝脂肪變性程度[20]。此外，miR-17還可靶向調(diào)控Tcf7l2上調(diào)成脂分化過程，而Tcf7l2作為Wnt通路的關鍵效應因子，被認為是T2DM發(fā)病的關鍵風險基因。同時，miR-20a過表達導致肝糖原合成增多，并通過靶向p63激活AKT/GSK信號通路，參與糖生成過程，而miR-20b可通過調(diào)控CD36表達影響脂質(zhì)代謝，在甘油三酯的異常積累中發(fā)揮關鍵作用。這些研究表明，上述miRNAs均在調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)膽固醇和糖脂代謝等能量代謝過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平與BMI和LDL-C均是導致NAFLD合并T2DM的危險因素，結合其它學者研究可知，miR-17、miR-20a、miR-20b 可能通過調(diào)控肝臟糖和脂質(zhì)代謝，在NAFLD患者發(fā)生T2DM過程中發(fā)揮一定的生物學功能，但其是否依賴于相同或相似的作用機制進行調(diào)節(jié)尚未明確，值得進一步研究。

本研究經(jīng)ROC分析顯示血清miR-17、miR-20a和miR-20b 對于嚴重的NAFLD具有一定的評估效能，是具有潛力的生物標志物。雖然臨床已報道了較多血清學指標用于NAFLD的臨床評估，但單指標往往存在靈敏度高，但特異性低的缺陷，聯(lián)合更多的指標對于提高診斷效能具有明顯的益處。目前，研究已闡明的NAFLD患者發(fā)生T2DM的發(fā)生機制有氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激改變、炎癥反應和凋亡等。當出現(xiàn)胰島素抵抗時，周圍組織對胰島素敏感性下降，葡萄糖利用率降低，導致糖和脂質(zhì)代謝的綜合性紊亂。血清miR-17、miR-20a和miR-20b在NAFLD發(fā)病過程中具體作用機制和對肝纖維化評估的作用仍不明確。本研究結果發(fā)現(xiàn)NAFLD合并T2DM患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b水平顯著上升，它們可能參與了NAFLD并發(fā)T2DM的發(fā)病過程，并對NAFLD的嚴重程度具有一定的診斷效能。但由于本研究是單中心研究，納入病例數(shù)少，可能存在選擇偏倚等缺陷，所得結論有待后續(xù)研究的不斷完善和補充。