首第文，周永健，徐豪明，唐文娟，駱慶玲，梅 情，寧 鋼，趙 沖，黃紅麗，曹創(chuàng)裕，陳慧婷

代謝相關(guān)性脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)是代謝綜合征的一部分，與2型糖尿病、胰島素抵抗和肥胖有關(guān)，已經(jīng)成為一個(gè)世界性的健康問(wèn)題[1, 2]。MAFLD的發(fā)病機(jī)制仍未完全確定，其中糖代謝紊亂[3]和腸道菌群調(diào)節(jié)失衡[4]是關(guān)鍵性因素。MAFLD患者存在腸道菌群紊亂，后者也影響胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝[5]。本研究旨在通過(guò)建立高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD小鼠動(dòng)物模型，分析不同時(shí)期其胰島素耐受情況和血糖水平變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、飼料、試劑和儀器 雄性SPF級(jí)C57BL/ 6 小鼠12只，8周齡，體質(zhì)量(22±1)g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心，每日交替進(jìn)行12 h光照和12 h黑暗，室內(nèi)相對(duì)濕度在(50±5)%，溫度在(23±1)℃。基礎(chǔ)飼料購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，60%高脂飼料購(gòu)于戴茨公司(美國(guó))，高脂飼料配方主要為：蛋白20% kcal，碳水化合物20% kcal，脂肪60% kcal。本實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則，在華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)監(jiān)管下完成。血糖儀和血糖檢測(cè)試紙(羅氏公司，中國(guó))，注射用10%葡萄糖溶液(廣東大冢制藥有限公司)，重組人胰島素注射液(通化東寶藥業(yè)股份有限公司)。DNA提取試劑盒(D3141，廣州美基生物科技有限公司)，Nanorop 微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000，賽默飛世爾科技，美國(guó))，PCR 相關(guān)試劑(TOYOBO，日本)， 瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-6C 型，北京六一儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-2500，上海天能科技有限公司)。PCR 儀(ETC811，東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)， Qubit 3.0(ThermoFischer Scientific，美國(guó))。

1.2 MAFLD模型的制備 給予60% kcal脂肪飲食[6]，分別在高脂飲食0 w、8 w、16 w和24 w時(shí)測(cè)量體質(zhì)量，并將小鼠置于代謝籠，收集糞便，將樣本立刻放入-80℃冰箱保存，統(tǒng)一行16 sRNA檢測(cè)；禁食不禁飲16 h，行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(glucose tolerance test，GTT)，經(jīng)尾靜脈取血，檢測(cè)空腹血糖[7]；禁食不禁飲4 h，行胰島素耐受實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT)，即給予小鼠人短效胰島素0.5 U.kg-1腹腔注射，分別在15 min、30 min、45 min、60 min、90 min和120 min取血，檢測(cè)血糖濃度，繪制血糖變化曲線，計(jì)算曲線下面積(AUC)[7]。

1.3糞便腸道菌群檢測(cè) 采用D3141試劑盒提取糞便DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 微量分光光度計(jì)檢測(cè)核酸，判斷DNA純度和濃度。擴(kuò)增16s rDNA的V3-V4目標(biāo)區(qū)域，引物序列如下：上游：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG，下游：3’-GGACTACHVGGGTATCTAAT。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為466 bp。使用ETC811分析儀進(jìn)行cDNA擴(kuò)增反應(yīng)。使用 ABI Step One Plus Real Time PCR System(Life Technologies，美國(guó)) 進(jìn)行定量。采用 Novaseq 6000的 PE250 模式 pooling 上機(jī)測(cè)序，廣州基迪奧生物科技有限公司提供專業(yè)的測(cè)序平臺(tái)和技術(shù)支持。α多樣性反映特定生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)物種多樣性情況，通常利用物種豐富度和均勻度兩個(gè)重要參數(shù)來(lái)計(jì)算。應(yīng)用Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)估計(jì)樣本中運(yùn)算的分類單位(operational taxonomic unit， OUT)數(shù)目，即物種的數(shù)目，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)的數(shù)值越大，代表樣本中所含物種越多[8]。

2 結(jié)果

2.1 四個(gè)時(shí)期小鼠葡萄糖耐量試驗(yàn)比較 隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，注射葡萄糖后小鼠血糖水平顯著升高(圖1)。

2.2 四個(gè)時(shí)期小鼠胰島素耐量試驗(yàn)比較 隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，注射胰島素后各時(shí)間小鼠血糖水平升高(圖2)。

圖2 不同時(shí)期小鼠ITT變化

2.3 不同時(shí)期小鼠糞便腸道菌群α多樣性比較 隨著高脂飲食喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠ACE指數(shù)和chao 1指數(shù)大幅升高(P<0.05，表1)。

表1 不同時(shí)期MAFLD小鼠腸道菌群α多樣性指數(shù)比較

2.4 四個(gè)時(shí)期小鼠糞便腸道菌群變化 在門水平，與0周比，喂養(yǎng)8周、16周和24周時(shí)小鼠菌群厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)比率顯著升高，而擬桿菌門(Bacteroidetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)比率顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在屬水平，與0周比，喂養(yǎng)8周小鼠菌群艾克曼菌(Akkermansia)和瘤胃球菌科-UCG-014屬(Ruminococcaceae_UCG-014)比率顯著降低，喂養(yǎng)16周小鼠菌群艾克曼菌和瘤胃球菌科-UCG-014屬比率顯著降低，而紅蝽?xiàng)U菌-UCG_002屬(Coriobacteriaceae-UCG-002)比率顯著升高(P<0.05)，喂養(yǎng)24周小鼠菌群艾克曼菌和瘤胃球菌科-UCG-014屬比率顯著降低，而紅蝽?xiàng)U菌科-UCG_002屬和杜氏桿菌比率顯著升高(P<0.05，圖3)。

圖3 不同時(shí)期小鼠屬水平腸道菌群差異比較(橫坐標(biāo)為時(shí)間(周)，縱坐標(biāo)為細(xì)菌含量百分比)

3 討論

近年來(lái)，MAFLD發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)逐年升高，已成為最常見(jiàn)的慢性肝病和與肝臟相關(guān)死亡的重要原因。腸道菌群失衡和糖代謝紊亂在MAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。采用高脂飲食建立的MALFD小鼠模型可形成肥胖和胰島素抵抗等表現(xiàn)[9]，與人類MAFLD發(fā)病機(jī)制和表現(xiàn)相似。MAFLD的發(fā)生發(fā)展及其嚴(yán)重程度與編碼炎性細(xì)菌產(chǎn)物的基因的豐富度有關(guān)。腸道微生物群的改變可能參與了MAFLD的發(fā)病，并可以作為疾病或嚴(yán)重程度的標(biāo)志[10]。在動(dòng)物模型，已有腸道細(xì)菌及其產(chǎn)物如何促進(jìn)脂肪變性、肝炎、纖維化、肝硬化和致癌作用的機(jī)制研究[11]。飲食干預(yù)介導(dǎo)的代謝性疾病模型在肝病的研究中有重要的作用，但同時(shí)飲食也是腸道菌群的重要影響因素，不同的造模時(shí)間可能對(duì)糖代謝和腸道菌群產(chǎn)生影響。本文通過(guò)研究高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD小鼠在不同時(shí)期血糖和腸道菌群的改變，為研究和建立高脂飲食MAFLD小鼠模型提供參考。

本研究采用60%kcal脂肪含量飲食[6]建立MAFLD小鼠模型，與人類NAFLD的代謝特征高度相似[11]，出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗。經(jīng)過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠血糖水平[7]，為模型建立提供成功依據(jù)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，隨著高脂飲食時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠空腹血糖大幅升高。在予以葡萄糖溶液注射后，血糖迅速顯著升高，且維持較長(zhǎng)一段時(shí)間高血糖水平，這種現(xiàn)象在24周高脂飲食喂養(yǎng)小鼠最為明顯。在注射胰島素后，高脂飲食喂養(yǎng)小鼠血糖下降緩慢且一直維持在較高水平，24周高脂飲食喂養(yǎng)小鼠血糖達(dá)到最高且下降緩慢，可能與胰島素敏感性降低，出現(xiàn)胰島素抵抗有關(guān)。研究表明MAFLD與胰島素抵抗、肥胖等代謝綜合征有密切的關(guān)系。以往有研究顯示，胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致MAFLD，而2型糖尿病的重要危險(xiǎn)因素就是MAFLD代謝調(diào)節(jié)能力降低和胰島素抵抗，隨著肝臟對(duì)葡萄糖生產(chǎn)的調(diào)節(jié)作用減弱，2型糖尿病也隨之發(fā)生[12,13]。體質(zhì)量、GTT和ITT均可以在一定程度上反映MAFLD小鼠疾病的嚴(yán)重程度，可以作為良好的觀察指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，隨著小鼠高脂飲食時(shí)間的延長(zhǎng)，其腸道菌群多樣性增加，可能與致病菌的種類和數(shù)量增加有關(guān)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在腸道菌群結(jié)構(gòu)方面，高脂飲食小鼠腸道厚壁菌門升高，擬桿菌門下降，厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)比值上升。既往研究發(fā)現(xiàn)肥胖與擬桿菌和厚壁菌門的相對(duì)豐度變化相關(guān)，與肥胖相關(guān)的微生物具有增加從飲食中獲取能量的能力，而且這種特性是可以傳遞的[14]。疣微菌門的顯著下降與艾克曼菌屬關(guān)系密切，后者在高脂飲食前小鼠腸道菌群占比為19%。小鼠接受高脂飲食的時(shí)間越長(zhǎng)，艾克曼菌占腸道菌群的比例越少。艾克曼菌是粘液層的一種共生細(xì)菌，可以利用粘蛋白作為唯一的碳源、氮源和能源。以往有研究表明，艾克曼菌通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟脂肪合成和炎癥基因表達(dá)預(yù)防脂肪肝[15]。研究還發(fā)現(xiàn)，艾克曼菌在正常人中比前驅(qū)糖尿病患者豐度更高，2型糖尿病的潛在標(biāo)志物可能是疣微菌門[16]。艾克曼菌可以調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和腸道免疫功能，某些食品成分(如多酚)可能會(huì)增加腸道中艾克曼菌的含量[17]，增加艾克曼菌可能有助于二甲雙胍的治療糖尿病作用[18]。因此，在高脂飲食動(dòng)物艾克曼菌顯著下降是重要的MAFLD特征，從8周開(kāi)始出現(xiàn)顯著下降，持續(xù)保持在低水平，是重要的MAFLD造模指示細(xì)菌之一。本研究發(fā)現(xiàn)，隨高脂飲食時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)一些差異細(xì)菌顯著減少，在MAFLD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)隨高脂飲食時(shí)間延長(zhǎng)，紅蝽?xiàng)U菌科-UCG_002屬和杜氏桿菌比率逐漸增加，提示上述細(xì)菌可能與MAFLD的氧化應(yīng)激和代謝表型相關(guān)[19]，在一定程度上可以反映MAFLD的嚴(yán)重程度。通過(guò)檢測(cè)上述細(xì)菌的比率，將可能成為MAFLD無(wú)創(chuàng)檢查評(píng)估手段之一。

綜上所述，隨著高脂飲食時(shí)間延長(zhǎng)，MAFLD小鼠血糖水平升高，腸道菌群多樣性增加，腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為艾克曼菌和瘤胃球菌科-UCG-014屬顯著下降，紅蝽?xiàng)U菌科-UCG_002屬和杜氏桿菌增加，提示腸道細(xì)菌變化與MAFLD疾病進(jìn)程相關(guān)。本研究對(duì)MAFLD小鼠腸道菌群改變進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，為建立以腸道菌群為研究核心的MAFLD小鼠模型提供了一定的參考依據(jù)，值得進(jìn)一步研究。