王光正，呂劍，毛娟，陳佰鴻，馮致，馬宗桓

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

番茄(SolanumlycopersicumL.)原產(chǎn)于南美洲西部的秘魯、智利、玻利維亞及厄瓜多爾等國(guó)家的高原或谷地,是茄科(Solanaceae)番茄屬(LycopersiconMiller)中以成熟多汁漿果為食用器官的草本植物[1].番茄是維生素的重要來(lái)源，也是小農(nóng)和中等規(guī)模商業(yè)農(nóng)民大量種植的經(jīng)濟(jì)作物.許多研究表明，番茄在農(nóng)藝條件允許的任何地方都是以商業(yè)化的數(shù)量種植的[2]，但在中國(guó)北方露地和設(shè)施早春栽培中，易受到低溫冷害，造成番茄生產(chǎn)受到嚴(yán)重影響.冷害會(huì)造成植株苗弱、生長(zhǎng)遲緩、萎蔫、黃化、局部壞死、坐果率低、產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降等不良影響[3].而在番茄幼苗期，低溫脅迫對(duì)植株影響尤為嚴(yán)重，番茄屬于冷敏感性強(qiáng)的作物，溫度低于10 ℃時(shí)生長(zhǎng)發(fā)育受阻，氣溫為8 ℃時(shí)，生長(zhǎng)量增加遲緩，5 ℃時(shí)生長(zhǎng)完全停止，生產(chǎn)上常因低溫的影響而使其生育期受阻[4].即使短期低溫，植株生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制.近些年在日光溫室的發(fā)展過(guò)程中，由于冬春季氣候變化和設(shè)施覆蓋材料保溫性、透光性能的局限性，易引起溫室內(nèi)低溫弱光等不良環(huán)境條件，限制了設(shè)施番茄的生產(chǎn)，使得冬春茬番茄的冷害問(wèn)題變得日益突出.眾多研究表明，低溫脅迫導(dǎo)致番茄生理代謝受到顯著抑制，如光合作用降低、抗氧化酶活性下降、葉綠素降解、生長(zhǎng)發(fā)育受阻等.因而，研究提高設(shè)施番茄在低溫脅迫下的適應(yīng)性顯得尤為重要[5-6].

前人研究中，發(fā)現(xiàn)許多類(lèi)型的激素可以提高番茄的低溫適應(yīng)性，例如褪黑素預(yù)處理可以通過(guò)降低番茄葉片氧化脅迫提高光合碳同化能力、提高番茄葉片的抗氧化能力、增加蔗糖、脯氨酸和多胺的積累來(lái)顯著緩解番茄低溫脅迫[7].油菜素內(nèi)酯(BR)是一種新型植物激素，在植物體內(nèi)含量極低，但生理活性卻極高，植物經(jīng)極低濃度BR處理后便能表現(xiàn)出明顯的生理效應(yīng)[8-10]，BR和褪黑素效果類(lèi)似，能減輕不同抗冷性的植物幼苗在低溫脅迫中的傷害作用，研究發(fā)現(xiàn)BR對(duì)低溫脅迫下番茄幼苗的光合機(jī)制有積極的影響[11]，而且BR能促進(jìn)幼苗根系和基葉的正常生長(zhǎng)和健壯度，其作用方式是通過(guò)阻止植物幼苗產(chǎn)生過(guò)多的自由基或誘導(dǎo)形成較多的自由基清除劑，例如抗氧化酶可以減輕膜脂過(guò)氧化作用，從而穩(wěn)定膜的結(jié)構(gòu)與功能，增強(qiáng)膜的防衛(wèi)能力，以適應(yīng)低溫逆境的變化[12-13].但BR是否對(duì)番茄在低溫脅迫下生長(zhǎng)有緩解的研究并不多見(jiàn)，本研究通過(guò)測(cè)定BR處理的番茄幼苗在不同時(shí)段低溫逆境下的生理指標(biāo)，來(lái)探究BR在番茄幼苗應(yīng)對(duì)低溫脅迫中的作用，旨在為番茄抗逆育種和品質(zhì)改良提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，同時(shí)也能對(duì)BR在番茄生產(chǎn)中的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義.

脫落酸(Abscisic acid,ABA)是一種以異戊二烯為基本單位的倍半萜羧酸，早在上世紀(jì)六十年代就被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是五大類(lèi)植物激素之一[14]，具有促進(jìn)脫落、促進(jìn)休眠、抑制生長(zhǎng)、提高抗逆性的作用.但是不同濃度的脫落酸對(duì)園藝作物有不同的影響，如在茄子幼苗的低溫脅迫中，10 mmol/L的ABA可以有效緩解茄子幼苗的低溫脅迫，而40 mmol/L的ABA緩解效果不明顯[15]，另外在低溫脅迫對(duì)豇豆幼苗生理生態(tài)影響的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)低濃度(10 mmol/L)的ABA緩解效果最好，高濃度(40 mmol/L)的ABA緩解效果不顯著[16].而B(niǎo)R作為抗逆境脅迫植物激素的新秀，可以通過(guò)與ABA互作參與調(diào)控植物的多種抗逆過(guò)程，但不同逆境所涉及的分子調(diào)控機(jī)制不同，因此BR和ABA的關(guān)系既有拮抗，又有協(xié)同，取決于所響應(yīng)的逆境種類(lèi).例如鹽脅迫條件下，BR拮抗ABA的耐鹽效應(yīng)；而在干旱和氧化脅迫條件下，BR與ABA共同提高植物的抗性等[17].但是ABA是否會(huì)對(duì)BR的抗低溫效果有抑制作用的研究也不多見(jiàn).本試驗(yàn)對(duì)低溫脅迫下的番茄幼苗分別噴施BR及其抑制劑ABA，以明確BR在不同時(shí)段緩解低溫脅迫的生理基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為番茄，品種為卡焰.番茄種子在60 ℃溫水浸種后用紗布包裹置于培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至氣候箱中進(jìn)行催芽，溫度設(shè)置為恒溫25 ℃，光照為0.發(fā)芽后在玻璃溫室中定植，基質(zhì)為草炭∶珍珠巖∶蛭石∶甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院自制營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)= 9∶3∶3∶1，每盆一株.育苗至兩片真葉期，期間每天澆水、每隔4 d噴施一次1 000倍的吡蟲(chóng)啉以防白粉虱，兩片真葉后移植到10 cm×10 cm小花盆中.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在番茄四葉期，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄植株(株高在15 cm左右)隨機(jī)分成3組，每組為一個(gè)處理，每個(gè)處理45株，每15株為一個(gè)重復(fù).然后將3個(gè)處理組植株都轉(zhuǎn)移至氣候箱中，條件設(shè)置為光周期為16 h光照、8 h黑暗，溫度為光照時(shí)10 ℃，黑暗條件下4 ℃，光照強(qiáng)度為4 000 lx，相對(duì)濕度為60%.3個(gè)處理分別為T(mén)1：噴灑去離子水；T2：噴灑0.5 μmol/L油菜素內(nèi)酯溶液；T3：噴灑0.5 μmol/L油菜素內(nèi)酯溶液和50 mmol/L脫落酸溶液；對(duì)照為T(mén)1.所有處理于每天上午9∶00噴灑一次相應(yīng)溶液，連續(xù)處理3 d，每次噴至葉面有水滴滴落為止.在開(kāi)始處理后的0、24、48、72 h取樣測(cè)定丙二醛含量、電導(dǎo)率、光合指標(biāo)、抗氧化酶活性、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性.

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 光合生理指標(biāo)的測(cè)定 利用LI-6400便攜式光合測(cè)定分析儀于晴天早上9∶00～11∶00測(cè)定光合生理學(xué)參數(shù)，測(cè)定時(shí)用開(kāi)放式氣路，大氣CO2濃度基本在340～380 μmol/mol，控制溫度25 ℃,相對(duì)濕度60%，PAR控制在1 000 μmol/(m·s)，測(cè)定葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci).

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定 電解質(zhì)滲透率和MDA含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[7]并稍作修改，SOD酶活性測(cè)定用氮藍(lán)四唑法[18]，POD酶活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[19]，CAT酶活性測(cè)定采用分光光度法[20].SS酶、SPS酶均采用(分光光度法)試劑盒進(jìn)行測(cè)定(蘇州科銘生物有限公司).

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行處理和圖表繪制，后用SPSS軟件進(jìn)行Duncan多重比較分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜素內(nèi)酯對(duì)番茄MDA和電解質(zhì)滲透率的影響

油菜素內(nèi)酯顯著抑制了番茄幼苗體內(nèi)的MDA含量，如圖1-A所示，脅迫72 h后，T2處理番茄的MDA含量?jī)H為6.406 μmol/g而T1處理番茄的MDA含量是T2的3倍，達(dá)到19.261 μmol/g.T3處理番茄的MDA含量是T2的1.6倍，為10.50 μmol/g，T2處理番茄的MDA含量顯著低于T1和T3.

T1：低溫；T2：低溫+BR；T3：低溫+BR+ABA.T1：Cold；T2：Cold+BR；T3：Cold+BR+ABA.圖1 油菜素內(nèi)酯及脫落酸對(duì)番茄葉片MDA含量以及電解質(zhì)滲透率的影響Figure 1 Chilling effect on malonaldehyde (MDA) content (A) and electrolyte leakage (B) in leaves of seedlings of tomato in different periods by BR and ABA

圖1-B顯示低溫脅迫下電解質(zhì)滲透率隨著脅迫時(shí)間的增加而增加，但油菜素內(nèi)酯顯著抑制了番茄幼苗體內(nèi)電導(dǎo)率的上升.脅迫72 h后，T2處理番茄的電導(dǎo)率為63%，而T1處理番茄的電解質(zhì)滲透率為93%，是T2的1.5倍.T3處理番茄的電解質(zhì)滲透率為80.6%，是T2的1.3倍，均顯著高于T2.

2.2 油菜素內(nèi)酯對(duì)番茄光合系統(tǒng)的影響

油菜素內(nèi)酯顯著緩解了低溫脅迫后番茄幼苗體內(nèi)Ci值的上升，脅迫72 h后，T1處理番茄的Ci是T2的1.3倍，T3是T2的1.2倍，T2處理番茄的Ci僅為564 μmol/mol，顯著小于T1和T3(圖2-A).

由圖2-B可以看出，脅迫24 h后，T2處理番茄的Pn為9.1 μmmol/(m·s)，是T1的4倍，是T3的1倍，差異顯著，并且在脅迫的72 h中，T2處理番茄的下降速度明顯慢于T1，說(shuō)明BR可以對(duì)保護(hù)番茄幼苗在低溫脅迫下的光合速率有一定作用.

對(duì)于氣孔導(dǎo)度，脅迫24 h后T2處理番茄的Gs為222 mmol/(m·s)，是T1、T3的1.3倍和1.2倍，脅迫48 h后T2的Gs下降到170 mmol/(m·s)，但仍然高于T1、T3，分別是T1、T3的1.5和1.3倍(圖2-C).

T1：低溫； T2：低溫+BR； T3：低溫+BR+ABA.T1：Cold； T2：Cold+BR； T3：Cold+BR+ABA.圖2 油菜素內(nèi)酯及脫落酸對(duì)番茄葉片光合系統(tǒng)的影響Figure 2 Photosynthetic traits as affected by BR and inhibitor in tomato leaves under cold stress

2.3 油菜素內(nèi)酯對(duì)番茄抗氧化酶活性的影響

24 h低溫脅迫后T2處理番茄的CAT活性為4.67 U/g，是T1、T3的1.6倍，脅迫48 h后達(dá)到6.93 U/g，是T1、T3的1.5倍.脅迫72 h后T2比T1和T3高了2.5倍、2.0倍(圖3-A)，達(dá)到12.68 U/g.3個(gè)時(shí)段T2處理番茄的CAT活性均顯著高于T1和T3.

T2處理番茄的POD活性在低溫脅迫48 h后達(dá)到19.52 U/g，是T1的1.5倍，是T3的1.3倍.在低溫脅迫72 h后升高到21.82 U/g，是T1的1.5倍，是T3的1.3倍，兩個(gè)時(shí)段下T2處理番茄的POD活性均顯著高于T1、T3(圖3-B)

低溫脅迫72 h后，T2處理番茄的SOD 活性為21.41 U/g，T1為11.71 U/g，T3為12.57 U/g，此時(shí)T2是T1的1.8倍，是T3的1.7倍，SOD活性均顯著高于T1和T3(圖3-C).

2.4 油菜素內(nèi)酯對(duì)番茄植株內(nèi)蔗糖代謝相關(guān)酶的影響

從圖4-A中可以看到，在3個(gè)處理中T1、T3兩組番茄的SPS增長(zhǎng)處理番茄極其微小，脅迫48 h后兩組分別增長(zhǎng)了59.02 μg/(min·g)、40.67 μg/(min·g)，但是T2處理番茄的SPS增長(zhǎng)顯著，48 h后增加了244.75 μg/(min·g).在低溫脅迫48 h時(shí)，T2處理番茄的SPS活性是T1、T3的SPS活性的1.6倍,即使在72 h時(shí)T2的SPS活性有所下降，也比其他兩個(gè)處理組高1.5倍，差異仍然顯著.

T1：低溫；T2：低溫+BR； T3：低溫+BR+ABA.T1：Cold；T2：Cold+BR；T3：Cold+BR+ABA.圖3 油菜素內(nèi)酯及抑制劑對(duì)番茄幼苗抗氧化酶活性的影響Figure 3 Changes in activities of antioxidant enzymes as affected by BR and inhibitor in tomato leaves under cold stress

低溫脅迫48 h時(shí)，T2處理番茄的SS為521.12 μg/(min·g)，是T1的1.5倍，是T3的1.3倍，在低溫脅迫72 h時(shí)T2處理番茄的SS為493.39 μg/(min·g)，比其余兩個(gè)處理高1.4倍(圖4-B)，均達(dá)到顯著差異.

T1：低溫；T2：低溫+BR；T3：低溫+BR+ABA.T1：Cold；T2：Cold+BR；T3：Cold+BR+ABA.圖4 低溫脅迫下油菜素內(nèi)酯及抑脫落酸對(duì)番茄幼苗蔗糖代謝相關(guān)酶活性的影響Figure 4 Changes in activities of sucrose metabolism-related enzymes as affected by BR and inhibitor in tomato leaves under cold stress

3 討論與結(jié)論

低溫脅迫下植物體內(nèi)首先受到損害的是細(xì)胞膜系統(tǒng).而MDA 含量和電解質(zhì)滲透率是用于表示細(xì)胞膜受損害程度的兩個(gè)重要指標(biāo)，有研究發(fā)現(xiàn)，外源BR能有效地緩解低溫脅迫對(duì)華山松幼苗的影響，降低活性氧對(duì)其幼苗的傷害，減輕膜脂過(guò)氧化程度，提高華山松幼苗的抗寒能力，還有研究發(fā)現(xiàn)BR可以有效抑制低溫脅迫下竹筍的MDA和電解質(zhì)的泄露[21-22].本試驗(yàn)中，低溫脅迫處理的番茄幼苗葉片中的 MDA含量和電導(dǎo)率迅速增加，但BR處理的番茄幼苗MDA含量和電導(dǎo)率在72 h時(shí)顯著優(yōu)于低溫脅迫處理的幼苗，表明細(xì)胞膜系統(tǒng)在低溫脅迫下會(huì)受到嚴(yán)重的氧化損傷，而B(niǎo)R處理則有效緩解了細(xì)胞膜的損傷從而保護(hù)番茄幼苗體內(nèi)膜系統(tǒng).

在羊草和油桐的低溫脅迫研究中也發(fā)現(xiàn)BR能夠減小低溫脅迫對(duì)細(xì)胞膜的毒害作用同時(shí)降低電解質(zhì)滲透率，從而提高這兩種植物的抗寒性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MDA 含量和電解質(zhì)滲透率的降低可能是由于番茄幼苗葉片中的抗氧化物酶活性增高引起的[23-24].許多研究表明BR的確能夠提高一些植物在脅迫環(huán)境下體內(nèi)抗氧化酶的活性[25-26]，比如在辣椒幼苗的抗低溫脅迫研究中發(fā)現(xiàn)低溫對(duì)辣椒幼苗體內(nèi)的抗氧化酶有顯著影響，而外源EBR處理可調(diào)節(jié)辣椒根系形態(tài)和提高根系抗氧化酶活性，增強(qiáng)植株抗低溫脅迫的能力[27-28].在野生垂穗披堿草幼苗的抗低溫研究中發(fā)現(xiàn)，施用BR后抗氧化酶基因的表達(dá)量均得到上調(diào)，說(shuō)明了BR對(duì)低溫具有有效的緩解作用[29].本試驗(yàn)中經(jīng)BR處理的低溫脅迫環(huán)境下的番茄幼苗在72 h時(shí)SOD、CAT、POD的活性都比不施用BR的番茄幼苗高(圖3)，這說(shuō)明BR處理對(duì)于提高番茄幼苗在逆境脅迫下的抗氧化能力以保護(hù)膜系統(tǒng)從而維持番茄幼苗生理代謝系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)具有明顯效果.

在BR對(duì)低溫脅迫下黃瓜幼苗光和系統(tǒng)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，BR可以有效緩解黃瓜在低溫脅迫下的光合作用[30]，而在上述羊草和油桐的研究中也證實(shí)了BR對(duì)植物光合系統(tǒng)的緩解作用和可溶性糖生成的促進(jìn)作用.而本試驗(yàn)中，BR處理的番茄幼苗Pn、Ci、Gs三項(xiàng)生理指標(biāo)均顯著優(yōu)于對(duì)照，說(shuō)明BR處理也可以緩解因低溫脅迫對(duì)番茄幼苗光合系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)的不利影響，保證光合作用的正常進(jìn)行.番茄幼苗經(jīng)48 h的脅迫后，BR處理的番茄幼苗SPS活性和SS活性是對(duì)照的1.67倍，說(shuō)明了BR對(duì)低溫脅迫下番茄幼苗體內(nèi)蔗糖的生成有一定促進(jìn)作用，在一定程度上可以幫助番茄幼苗維持體內(nèi)的可溶性糖含量以維持滲透平衡從而保護(hù)幼苗的生理代謝.

脫落酸(ABA)是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，它能促進(jìn)葉片衰老，加快植株代謝.擬南芥基因芯片結(jié)果顯示BR和ABA協(xié)同調(diào)控超過(guò)200個(gè)共同的目標(biāo)基因，還有研究發(fā)現(xiàn)BR處理擬南芥和油菜種子可提高植株對(duì)干旱和低溫脅迫的耐受性，該過(guò)程涉及對(duì)ABA合成及多個(gè)脅迫相關(guān)基因(RD29A、ERD10和RD22)表達(dá)的誘導(dǎo)[17].在本試驗(yàn)中，BR和ABA同時(shí)處理的番茄幼苗在脅迫72 h后其電導(dǎo)率是經(jīng)BR處理幼苗的1.28倍、MDA含量是BR處理的1.64倍、Pn是BR處理的2.26倍；在抗氧化物酶活性上，只經(jīng)BR處理的幼苗比BR、ABA共處理的幼苗高1倍以上；脅迫48 h后，只經(jīng)BR處理的幼苗的SPS活性和SS活性是BR、ABA共處理的1.3倍.這些數(shù)據(jù)表明若在番茄幼苗的抗低溫脅迫中ABA和BR同時(shí)施用，那么ABA會(huì)對(duì)BR的低溫緩解效果產(chǎn)生抑制作用.

綜上所述，BR處理的番茄幼苗在低溫逆境下的各項(xiàng)生理指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照，并在72 h時(shí)保護(hù)番茄幼苗膜系統(tǒng)完整性的效果最顯著，在48 h時(shí)對(duì)番茄幼苗體內(nèi)蔗糖轉(zhuǎn)化的促進(jìn)效果最顯著，表明BR在保護(hù)膜系統(tǒng)、提高幼苗抗氧化能力、保護(hù)光合系統(tǒng)、維持滲透平衡方面有著十分顯著的效果.意味著B(niǎo)R對(duì)于低溫逆境下番茄幼苗的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)和保護(hù)作用，可以提高番茄幼苗對(duì)低溫脅迫下的抗性.而ABA對(duì)BR具有抑制作用，二者同時(shí)施用不會(huì)提高番茄幼苗的抗冷性.