張桂娟 陳繼凌 陶薈竹

(1. 黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025；2. 精華制藥集團(tuán)股份有限公司，江蘇 南通 226000)

龍牙楤木[Araliaelata(Miq.)Seem.]為五加科楤木屬多年生落葉小喬木，又名遼東楤木、刺嫩牙，可藥食兩用，其根皮和樹皮多為藥用部分，嫩芽被譽(yù)為“山菜之王”。龍牙楤木具有補(bǔ)氣安神、除濕止痛、活血祛風(fēng)的功能，臨床上常用于治療神經(jīng)衰弱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、胃病等[1]，主要含皂苷、多糖、黃酮及揮發(fā)油等[2-4]成分；其中，多糖類成分具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗輻射損傷等作用[5-6]。

目前，常見(jiàn)的多糖提取方法有熱水浸提法[7]、酸提取法[8]、堿提取法[9]、超聲波輔助提取法[10]、微波輔助提取法[11]和酶提取法[12]等，而龍牙楤木多糖的提取方法僅見(jiàn)于熱水浸提[13]及超聲波輔助提取[14]。近年來(lái)，酶提取法具有提取條件溫和，可破壞植物細(xì)胞壁而加速有效成分釋放，縮短提取時(shí)間，并可減少干擾物質(zhì)溶出，因此，被廣泛應(yīng)用于天然植物有效成分的提取[15-17]。其中，纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶為常用酶類，纖維素酶可水解植物細(xì)胞壁組成成分纖維素，木瓜蛋白酶對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，有助于糖蛋白復(fù)合物的水解而釋放更多多糖，提高提取率。由于植物細(xì)胞壁組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單一酶破解細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較難，易導(dǎo)致成分溶出不完全。試驗(yàn)擬選用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶提取龍牙楤木多糖，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并考察其抗氧化能力，以期為龍牙楤木多糖精深產(chǎn)品加工、資源合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

龍牙楤木：采自黑龍江省伊春市，春季新發(fā)的嫩芽；

石油醚、乙醚、95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH)、硫酸鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

纖維素酶(1×104U/g)、果膠酶(4.9×103U/g)、木瓜蛋白酶(5×105U/g)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

抗壞血酸：分析純，無(wú)錫市亞盛化工有限公司；

純化水：pH 7.0～7.5，自制。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-2200型，北京瑞利分析儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫振蕩器：WHY-2型，常州普天儀器制造有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-501型，河南宇科自動(dòng)化儀器儀表設(shè)備有限公司；

循環(huán)水真空泵：SHZ-DⅢ型，上海英化儀器設(shè)備有限公司；

電子天平：ESJ200-4型，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 龍牙楤木預(yù)處理 取龍牙楤木嫩芽鮮品于80 ℃烘干24 h，再于60 ℃烘干至恒重，粉碎成粗粉。石油醚超聲脫脂1 h，過(guò)濾，揮干石油醚，干燥粗粉備用。

1.2.2 多糖提取工藝

干燥龍牙楤木粗粉→復(fù)合酶水解→減壓濃縮→醇沉→靜置過(guò)夜→離心得沉淀→有機(jī)溶劑洗滌→揮干有機(jī)溶劑→龍牙楤木粗多糖

1.2.3 多糖提取率測(cè)定 采用苯酚—濃硫酸法[14]。按式(1) 計(jì)算多糖提取率。

(1)

式中：

E——多糖提取率，%；

C——供試品多糖質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——供試品溶液定容體積，mL；

D——稀釋倍數(shù)；

W——龍牙楤木樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

(1) 料液比：精密稱取一定量龍牙楤木粗粉，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%分別加入纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶，用pH 5.5的磷酸氫二鈉與檸檬酸緩沖液作為提取溶劑，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間60 min，考察料液比[(m龍牙楤木粗粉∶V緩沖液)分別為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40 (g/mL)]對(duì)多糖提取率的影響。

(2) 酶解時(shí)間:精密稱取一定量龍牙楤木粗粉，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%分別加入纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶，用pH 5.5的磷酸氫二鈉與檸檬酸緩沖液作為提取溶劑，料液比(m龍牙楤木粗粉∶V緩沖液)1∶25 (g/mL)，酶解溫度50 ℃，考察酶解時(shí)間(30，60，90，120，150，180 min)對(duì)多糖提取率的影響。

(3) 酶解溫度：精密稱取一定量龍牙楤木粗粉，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%分別加入纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶，用pH 5.5的磷酸氫二鈉與檸檬酸緩沖液作為提取溶劑，料液比(m龍牙楤木粗粉∶V緩沖液)1∶25 (g/mL)，酶解時(shí)間60 min，考察酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對(duì)多糖提取率的影響。

(4) 緩沖液pH值：精密稱取一定量龍牙楤木粗粉，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%分別加入纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶，用磷酸氫二鈉與檸檬酸緩沖液作為提取溶劑，料液比(m龍牙楤木粗粉∶V緩沖液)1∶25 (g/mL)，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間60 min，考察緩沖液pH值(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)對(duì)多糖提取率的影響。

1.2.5 復(fù)合酶酶量配比正交試驗(yàn) 精密稱取一定量龍牙楤木粗粉，在單因素試驗(yàn)最適料液比、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值下，以纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的添加量為因素，以龍牙楤木多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，確定3種酶的最佳添加量。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理[18-19]，以多糖提取率為響應(yīng)值，以酶解時(shí)間、料液比、酶解溫度為響應(yīng)因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。利用Design Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行回歸分析，優(yōu)化提取工藝。

1.2.7 抗氧化能力的測(cè)定

(1) DPPH自由基清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[20-21]并修改。將DPPH自由基溶于無(wú)水乙醇，制成0.1 mmol/L試液。精密量取1 mL不同濃度待測(cè)樣品于試管中，加入3.0 mL DPPH試液，4.0 mL無(wú)水乙醇，混勻，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處吸光度值，以DPPH自由基試液作空白，按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

R——自由基清除率，%；

A0——空白試液吸光度值；

An——樣品反應(yīng)液吸光度值。

(2) 羥自由基清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[22]并修改。精密量取3 mL不同濃度的龍牙楤木多糖溶液于10 mL容量瓶中，依次精密加入0.1 mol/L硫酸鐵溶液、0.1 mol/L水楊酸溶液及0.1 mol/L過(guò)氧化氫溶液各2 mL，純化水定容，37 ℃水浴30 min，測(cè)定510 nm處吸光度值，按式(2)計(jì)算羥自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 8.0.5、Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比 由圖1可知，多糖提取率隨料液比的增加先短暫降低后升高再下降，當(dāng)料液比(m龍牙楤木粗粉∶V緩沖液)為1∶30 (g/mL)時(shí)，多糖提取率最大。說(shuō)明隨著提取溶劑的增加，可能因不同酶的作用起效快慢不同，其破壞細(xì)胞壁及水解糖蛋白釋放多糖的功能優(yōu)勢(shì)不同[23]，當(dāng)料液比增加至一定范圍時(shí)，酶破解細(xì)胞壁的能力達(dá)到限度值，而未被酶破壞的細(xì)胞內(nèi)外濃度差亦無(wú)明顯變化，多糖釋放量及溶出量穩(wěn)定[24]。故料液比(m龍牙楤木粗粉∶V緩沖液)以1∶30 (g/mL)為宜。

圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

2.1.2 酶解時(shí)間 由圖2可知，多糖提取率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后暫時(shí)降低再升高再降低，當(dāng)酶解時(shí)間為150 min時(shí)，多糖提取率達(dá)最大值。這可能是由于試驗(yàn)選用的為復(fù)合酶，而不同酶的起效作用時(shí)間及作用強(qiáng)度不同,或復(fù)合酶在釋放細(xì)胞內(nèi)多糖及其他成分的同時(shí)，對(duì)部分多糖糖苷鍵起水解作用[25]。故酶解時(shí)間以150 min為宜。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.1.3 酶解溫度 由圖3可知，多糖提取率隨酶解溫度的升高先增加后降低，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，多糖提取率達(dá)最大值，說(shuō)明復(fù)合酶隨著酶解溫度的升高活力增強(qiáng)，加快多糖的溶出，當(dāng)酶解溫度升高至一定值后，酶活力下降，提取率降低[26]。因此，酶解溫度以50 ℃為宜。

圖3 酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.1.4 緩沖液pH值 由圖4可知，隨著pH值的升高，多糖提取率逐漸降低，當(dāng)pH值為3.5～4.0時(shí)，提取率最高，可能是果膠酶在復(fù)合酶提取多糖過(guò)程中起主導(dǎo)作用，其在偏酸性條件下酶解作用強(qiáng)，亦或是龍牙楤木細(xì)胞中含堿性成分綜合其溶劑的酸性，使釋放的多糖未被酸水解而保留于溶劑中[27]。同時(shí)，為簡(jiǎn)化操作，測(cè)得以自制純化水為溶劑，溶液pH值為5.96時(shí)的多糖提取率與pH值

圖4 緩沖液pH值對(duì)多糖提取率的影響

為4.0時(shí)相近，因此，選擇以純化水為提取溶劑。

2.2 復(fù)合酶酶量配比正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)最適料液比、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值下，以纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的添加量為因素，以龍牙楤木多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 復(fù)合酶酶量配比正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表2可知，各因素對(duì)多糖提取率的影響程度依次為木瓜蛋白酶>果膠酶>纖維素酶。由表3可知，果膠酶添加量與木瓜蛋白酶添加量對(duì)多糖提取率影響顯著，纖維素酶添加量對(duì)多糖提取率的影響不顯著，從節(jié)約物料成本投入角度綜合考慮，最佳復(fù)合酶酶量配比為A1B2C1，即纖維素酶添加量1.0%、果膠酶添加量1.5%、木瓜蛋白酶添加量0.5%。

表3 方差分析表?

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比為相應(yīng)變量，以多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表5。

利用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得二次回歸方程：

(3)

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 方差分析表?

2.3.2 響應(yīng)曲面圖及等高線圖 由圖5～圖7可知，酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比對(duì)龍牙楤木多糖提取率影響較大，表現(xiàn)為曲面陡峭。酶解時(shí)間與酶解溫度的交互作用強(qiáng)于酶解溫度與料液比的交互作用，而酶解時(shí)間與料液比的交互作用最弱。

圖5 酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)多糖提取率的影響

圖6 酶解溫度與液料比的交互作用對(duì)多糖提取率的影響

圖7 酶解時(shí)間與液料比的交互作用對(duì)多糖提取率的影響

2.3.3 模型驗(yàn)證 由Design-Expert 8.0.5軟件得出復(fù)合酶法提取龍牙楤木多糖最佳工藝為：酶解溫度53.7 ℃，酶解時(shí)間160.2 min，料液比(m龍牙楤木粗粉∶V純化水)1.00∶31.05 (g/mL),此時(shí)預(yù)測(cè)龍牙楤木多糖提取率為10.78%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將最佳提取工藝調(diào)整為：酶解溫度54 ℃，酶解時(shí)間160 min，料液比(m龍牙楤木粗粉∶V純化水)1∶31 (g/mL)，此條件下的龍牙楤木多糖提取率為(10.68±0.05)%(n=3)，與預(yù)測(cè)值接近，且較熱水浸提(5.87%)[13]和超聲波輔助提取(4.81%)[14]的分別提高了81.94%和122.04%，說(shuō)明該模型對(duì)龍牙楤木多糖提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 由圖8可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0～8 mg/mL時(shí)，3種提取方法所得多糖對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除作用，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除能力升高。3種提取方法所得多糖清除DPPH自由基的IC50值分別為6.76，4.96，2.00 mg/mL，但三者對(duì)DPPH自由基的清除率均低于維生素C。

圖8 3種多糖對(duì)DPPH自由基清除率的影響

2.4.2 羥基自由基清除能力 由圖9可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0～10 mg/mL時(shí)，熱水浸提法、超聲輔助提取法、復(fù)合酶法所得龍牙楤木多糖對(duì)羥基自由基均具有清除作用，且清除率隨多糖質(zhì)量濃度的增加而上升。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為8～10 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率上升趨勢(shì)減弱，最大值分別為54.42%，60.13%，70.10%。3種提取方法所得多糖清除羥基自由基的IC50值分別為6.75，5.25，3.05 mg/mL，三者對(duì)羥基自由基的清除率低于維生素C。

圖9 3種多糖對(duì)羥基自由基清除率的影響

3 結(jié)論

以龍牙楤木為原料，以純化水為溶劑，采用復(fù)合酶法提取龍牙楤木多糖，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并分析其抗氧化活性。結(jié)果表明，復(fù)合酶法提取龍牙楤木多糖的最佳條件為纖維素酶添加量1.0%，果膠酶添加量1.5%，木瓜蛋白酶添加量0.5%，酶解溫度54 ℃，酶解時(shí)間160 min，料液比(m龍牙楤木粗粉∶V純化水)1∶31 (g/mL)，此條件下龍牙楤木多糖提取率為(10.68±0.05)%，與預(yù)測(cè)值接近。抗氧化試驗(yàn)表明，龍牙楤木多糖對(duì)DPPH自由基及羥基自由基的IC50值分別為2.00，3.05 mg/mL，且清除作用均隨多糖質(zhì)量濃度的增大而升高，清除率最大值分別為78.10%和70.10%，表明龍牙楤木多糖具有良好的抗氧化活性。后續(xù)需研究龍牙楤木多糖的純化、分離及結(jié)構(gòu)鑒定等。