王丹麗 劉 璐 張逸凡 連喜軍

(1. 天津商業(yè)大學理學院，天津 300134；2. 天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；3. 天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134)

小麥醇溶蛋白為單體蛋白，分為α、β、γ、ω4種不同類型，是面筋蛋白的重要組分[1-2]。麥醇溶蛋白缺乏彈性，使面筋黏稠并具有延展性和流通性，因其能促進小麥淀粉回生，因此可作為食品添加劑用于制備高品質的回生淀粉[3-7]。利用體積分數(shù)為65%的乙醇水溶液浸泡谷朊粉提取醇溶蛋白是制備醇溶蛋白的常用方法[8-9]，但關于從提取液中分離出醇溶蛋白固體及將不同性質醇溶蛋白組分分離的研究較少。利用高效液相色譜層析方法可鑒定和分離醇溶蛋白，該方法準確度高、重現(xiàn)性好，但試驗成本高，而且分離時間長、產物少[10-11]。

柱層析法是利用混合物中各組分在固定相和流動相中溶解度的差異，經多次分配將各組分分離而達到純化的目的[12]。柱層析試驗設備簡單，且分離產物純度比較高[13]。該法被廣泛應用于制藥、食品、化工等領域[14-16]。沸石是天然存在且分布廣泛的離子交換材料，具有選擇性吸附和篩分能力，可用于柱層析的固定相中[17-18]。與高效液相色譜層析方法相比，采用改性沸石柱層析制備不同分子量醇溶蛋白組分，不需要昂貴設備，過程簡單，可高效分離出不同分子量的醇溶蛋白組分。

試驗擬研究堿液處理沸石分離不同性質醇溶蛋白組分工藝，以期為乙醇浸提谷朊粉制備醇溶蛋白提供可借鑒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉：思象粉業(yè)有限公司；

無水乙醇、氫氧化鉀：分析純，天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；

堿性蛋白酶：2 000 U/g，天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；

天然沸石(黑火山土)：市售；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DH-101-3BS型，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；

低速離心機：L535-1型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

紫外可見分光光度計：Lambda25型，美國PerkinElmer公司；

臺式電熱恒溫培育箱：WP25A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

掃描式電子顯微鏡：KH-8700型，浩視中國有限公司；

旋轉蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

增力電動攪拌器：JJ-1型，天津市華儀鑫達儀器儀表有限公司；

電子天平：YD202N型，上海精密科學儀器有限公司；

液相色譜儀：安捷倫1260 Infinity Ⅱ型，安捷倫科技公司；

多角度激光光散射儀：DAWN HELEOS Ⅱ型，美國懷雅特公司；

動態(tài)激光光散射儀：DynaPro NanoStar型，美國懷雅特公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 醇溶蛋白粗提物制備 將市售谷朊粉200 g按液料比(V乙醇∶m谷朊粉)30∶1 (mL/g)溶于體積分數(shù)為65%的乙醇，置于30 ℃水浴中并攪拌2 h，3次離心(3 500 r/min，3 min)，取上清液，用旋轉蒸發(fā)器蒸出乙醇后，所得濃縮液為醇溶蛋白組分1；將提取的上清液冷藏，分別于4，10，20，30 ℃下靜置凝沉1，2，4，8，10，20，40 h，所得沉淀為醇溶蛋白組分2，該醇溶蛋白干重與谷朊粉干重(每200 g谷朊粉的干重為48 g)的比值為凝沉率；用旋轉蒸發(fā)器將冷藏后的上清液濃縮凍融后離心，所得上清液為醇溶蛋白組分3，沉淀為醇溶蛋白組分4。測量沉淀的質量并通過光學顯微鏡觀察樣品形貌。

1.2.2 沸石堿處理 向玻璃瓶中加入500 g沸石，然后加入KOH溶液(質量分數(shù)分別為20%，50%，80%)直至沒過沸石1～2 cm。將裝有沸石的玻璃瓶放入水浴鍋中，分別設定4個不同加熱溫度(30，50，70，90 ℃)和3個不同加熱時間(30，60，120 min)；將KOH溶液處理過后的沸石加蒸餾水洗至中性，自然風干。

1.2.3 沸石吸附醇溶蛋白 將4 ℃下靜置凝沉12 h制備的醇溶蛋白溶解于體積分數(shù)為65%的乙醇中，向其中加入經KOH處理并干燥的沸石，沸石量沒過溶液即可，吸附3 h后將溶液倒出。

1.2.4 醇溶蛋白組分分離 采用層析法。將乙醇作為柱層析中的流動相，以經堿處理的沸石為固定相，向層析柱中加入已經KOH處理并吸附過醇溶蛋白的沸石，量取適量的無水乙醇倒入層析柱中，乙醇溶液沒過沸石1～2 cm(約為300 mL)，待沸石吸附10 min后，打開開關將層析出的醇溶蛋白溶液放出，每個樣品層析出的液體按照順序平均分為三等份接出，每個組分為100 mL，分別標記為A、B、C。

1.2.5 醇溶蛋白紫外最大吸收波長的確定 將每個樣品的3個組分在4 ℃下冷藏12 h后，取出樣品，將上清液收集在一起后用旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇，剩余液體冷藏所得沉淀即為醇溶蛋白，將樣品去皮后稱其重量，分析堿質量分數(shù)、堿處理時間、堿處理溫度對沸石分離醇溶蛋白組分的重量的影響。取出若干試管，向其內加入4～5 mL的體積分數(shù)為65%的乙醇，用鉤針鉤取每個樣品的每個組分的沉淀，放入乙醇液中充分溶解后采用紫外分光光度計測定其紫外最大吸收波長。

1.2.6 醇溶蛋白分子量測定 按照文獻[19]的測定方法，以沸石柱層析分離所得三組分作為流動相，利用高效凝膠滲透色譜聯(lián)用多角度激光散射和示差折光儀(HPSEC-MALLS-RID)進行分析，采用Astra6 軟件收集和處理數(shù)據。

1.3 統(tǒng)計學處理

每個數(shù)據均取自3個重復試驗的均值，采用F檢驗，利用SPSS軟件進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 醇溶蛋白凝沉率與靜置凝沉溫度及時間關系

將谷朊粉醇提溶液分別在4，10，20，30 ℃下靜置凝沉1，2，4，8，10，20，40 h，測定凝沉出的醇溶蛋白凝沉率，結果如圖1所示。

圖1 醇溶蛋白凝沉率與靜置凝沉溫度及時間的關系

由圖1可知，靜置凝沉前1 h，4，10 ℃兩組樣品醇溶蛋白凝沉速率迅速增長且遠多于另外兩組，另外兩組幾乎未凝沉出醇溶蛋白；1～4 h時，20，30 ℃兩組樣品凝沉速率開始緩慢增長，而4，10 ℃兩組醇溶蛋白增長趨緩；4～20 h時，20，30 ℃兩組樣品凝沉速率小幅增長，20 h時兩溫度下沉淀量接近，4 ℃下的凝沉率比其他各組都快，沉淀量超過了10 ℃的樣品，成為沉淀量最多的組分，而10 ℃下的樣品凝沉較為緩慢。凝沉20～40 h時，20，30 ℃兩組樣品凝沉速度加快。靜置40 h后，4，10，20，30 ℃下醇溶蛋白的凝沉率分別為16.6%，20.6%，24.0%，18.9%，經40 h靜置凝沉之后，30 ℃和10 ℃下最終提取的醇溶蛋白質量相近，而20 ℃下的樣品提取量最大，4 ℃下能更快地凝沉出接近最大沉淀量的醇溶蛋白。

2.2 不同溫度和時間沉淀出醇溶蛋白光學顯微圖像特征差異比較

圖2為不同溫度和時間醇溶蛋白提取液及凍融沉淀的光學圖像特征差異比較。將第1組分和第3組分進行對比，可以看出第1組分的醇溶蛋白聚集程度相對較低，可見通過凍融之后，醇溶蛋白的聚集程度獲得了提升，說明樣品經凍融處理更加容易提取。將第2組分和第4組分進行對比，可以看出醇溶蛋白形狀上有明顯變化，第2組分的醇溶蛋白以小體型聚集為主，而且形狀扁平，第4組分的醇溶蛋白則是體型偏大的聚集為主。說明經過冷凍之后，樣品中醇溶蛋白的聚集性比僅經過冷藏的樣品強，更容易凝聚沉淀。因此，要想得到更多的醇溶蛋白提取物，宜將谷朊粉醇提液濃縮后先進行冷藏，再進行凍融處理。

圖2 不同溫度和時間醇溶蛋白提取液及沉淀的光學顯微圖像特征差異比較

圖3為不同溫度和時間下，靜置凝沉醇溶蛋白的光學圖像特征差異比較。由圖3可以看出，在第1 h冷藏凝沉醇溶蛋白的圖像中，4個溫度下的醇溶蛋白分布都比較散亂，大小各不相同且無規(guī)律。第2 h的與第1 h時相似，但球狀醇溶蛋白(α-、β-、γ-醇溶蛋白[20-21])逐漸匯聚。第4 h的圖像中，在4，10 ℃下靜置凝沉的醇溶蛋白都接近圓形，且聚集程度更高，而另外兩組的醇溶蛋白形狀無規(guī)律，且分布較分散。第10 h的圖像中，4 ℃的出現(xiàn)了蟲狀醇溶蛋白(ω-醇溶蛋白[22])，10 ℃的醇溶蛋白出現(xiàn)了程度較輕的變扁，20 ℃的醇溶蛋白呈橢圓狀，這3個溫度下凝沉的醇溶蛋白分布均較為集中，且4 ℃的醇溶蛋白最為集中；40 ℃樣品顯微圖像中醇溶蛋白形狀依舊無規(guī)律且分布較為散亂。在20 h時，4，10，20 ℃的樣品均以蟲形ω-醇溶蛋白為主，夾雜部分橢圓形醇溶蛋白，密集程度都較高，30 ℃的樣品依舊是以圓形的α-、β-、γ-醇溶蛋白為主，且密集程度則稍微稀疏一些。在40 h的樣品圖像中，不同溫度下的醇溶蛋白皆以圓形為主，僅含有少量蟲狀ω-醇溶蛋白，可能在此階段球狀α-、β-、γ-醇溶蛋白聚集到蟲狀ω-醇溶蛋白表面，相互融合形成了大的球狀結構。綜上所述，為了高效制備醇溶蛋白，4 ℃靜置冷藏效果最佳。

圖3 不同溫度和時間沉淀出醇溶蛋白光學顯微圖像特征差異比較

2.3 預處理條件對沸石分離醇溶蛋白組分的影響

圖4和圖5為經不同工藝預處理沸石對分離醇溶蛋白提取量及其組分紫外吸收光譜的影響。由圖4可知，在不同處理溫度和不同處理時間情況下均表現(xiàn)出KOH溶液質量分數(shù)越低，分離出醇溶蛋白的量越多的規(guī)律。即，所分離的醇溶蛋白的量與KOH溶液質量分數(shù)呈反比。結合圖5(a)可知，在溫度為30 ℃、處理時間為30 min的條件下，KOH溶液質量分數(shù)為20%，50%，80%時，組分A的最大吸收波長分別為288.4，288.6，288.6 nm，吸光度分別為0.471，0.291，0.219，KOH質量分數(shù)為20%時的吸光度最大且峰形窄。因此，質量分數(shù)為20%時分離出醇溶蛋白最純。

同樣，由圖4可見，沸石處理時間越長，所分離出來的醇溶蛋白量也越多，結合圖5(b)可以得到，沸石處理時間為30，60，120 min的最大吸收波長分別為288.4，288.0，289.6 nm，吸光度分別為0.351，0.368，0.605，時間為120 min時吸光度最大且峰形窄。因此，處理沸石時間為120 min時分離出的醇溶蛋白最純。

圖4 不同工藝預處理沸石對分離醇溶

由圖4還可以看出，在沸石改性中，隨溫度上升，沉淀重量先上升后減少，然后再上升，即大多條件下，溫度在50 ℃時所分離出的蛋白量最多，結合圖5(c)可得出，在50，70，90 ℃下，組分A的最大吸收波長為288.0，288.4，289.6 nm，吸光度分別為0.364，0.308，0.164，溫度為50 ℃時的吸光度最大且峰形窄。因此，處理沸石溫度為50 ℃時分離出醇溶蛋白最純。

由單因素結果可知，沸石處理溫度為50 ℃、KOH溶液質量分數(shù)為20%、處理時間為120 min時醇溶蛋白分離量最大。按照最佳工藝參數(shù)醇溶蛋白最大分離量為10.336 g/kg沸石，同組未經堿液處理沸石所分離出的醇溶蛋白為4.730 g/kg沸石，分離最大量相較于空白試驗分離量多出5.606 g/kg沸石。進而觀察同一組樣品分離出的3個組分的蛋白是否一樣。由圖5(d)可知，分離出的醇溶蛋白不同組分的最大吸收波長基本相同，通過紫外最大吸收波長無法判斷醇溶蛋白中α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白各組分的比例。

圖5 不同方式預處理沸石后所分離醇溶蛋白組分的紫外吸收光譜圖

2.4 沸石分離醇溶蛋白組分中醇溶蛋白各組分比例

表1為沸石柱層析分離所得三組分中醇溶蛋白組分分子量及含量。由表1可知，柱層析A組分主要成分是低分子量醇溶谷蛋白，B組分主要成分是高低分子醇溶谷蛋白和α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白，C組分主要成分為低分子量醇溶谷蛋白。但C組分中的高分子量醇溶谷蛋白分子量比A、B組分中的大很多，進而使該組分的平均分子量遠遠大于A、B組分。大分子量醇溶谷蛋白對于面筋延展性具有重要作用，因而制備該類蛋白添加劑用于面條等食品中可大大減小面條煮熟過程的斷條率。

表1 沸石柱層析分離所得三組分中醇溶蛋白組分分子量及含量?

3 結論

通過對不同條件下的醇溶蛋白的提取情況以及其提取物的顯微圖像進行分析，探究醇溶蛋白的最佳提取條件，并以最佳條件下制備的醇溶蛋白為原料，通過對分離情況及紫外波長、蛋白組分分子量等分析研究堿液處理沸石分離醇溶蛋白組分工藝。結果表明，溫度對醇溶蛋白凝沉速率影響很大，貯存在4 ℃環(huán)境下谷朊粉中提取醇溶蛋白的效果最好，提取率可達24%；KOH改性沸石后所分離醇溶蛋白量與KOH溶液質量分數(shù)呈反比，與改性時間呈正比，溫度為50 ℃、KOH溶液質量分數(shù)為20%、處理時間為120 min時預處理沸石醇溶蛋白分離量最大，分離量為10.336 g/kg沸石，相較于空白試驗分離量多出5.606 g/kg沸石。根據紫外波長分析，醇溶蛋白及其組分的最大紫外吸收波長在288.4 nm附近。靜置凝沉過程中醇溶蛋白中α-、β-、γ-醇溶蛋白組分先沉淀析出，ω-醇溶蛋白組分最后凝沉析出。高分子量醇溶谷蛋白對于面筋延展性具有重要作用，因此對于分子量范圍分布更窄的高分子量醇溶谷蛋白組分分離及應用是未來的研究和發(fā)展方向。