彭 穎

(長(zhǎng)沙商貿(mào)旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410016)

冠突散囊菌又名金花菌，是傳統(tǒng)茯磚茶通過(guò)獨(dú)特的“發(fā)花”工藝長(zhǎng)成的黃色真菌[1]。冠突散囊菌不僅能改善茯磚茶的色、香、味，還能使其具備降膽固醇[2]、抗氧化[3-4]及降血糖[5]作用，并能提高α-淀粉酶、蛋白酶活力[6]，抑制脂肪酶活力[7]。李佳蓮等[8]研究發(fā)現(xiàn)，茯磚茶浸提液和冠突散囊菌的發(fā)酵液均有明顯的抑菌作用；Wang等[9]證實(shí)用茯磚茶水提物灌胃被大腸桿菌感染的小鼠，能激活小鼠的免疫功能。

環(huán)磷酰胺作為一種廣譜抗腫瘤藥物，雖然療效顯著，但卻同時(shí)損傷正常細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制和骨髓抑制，使得其在醫(yī)學(xué)治療上的應(yīng)用受到限制[10]。中國(guó)自古就有將具有藥效作用的茯苓、冬蟲(chóng)夏草、靈芝等真菌作為食物輔料，摻入人們的日常飲食中以達(dá)到強(qiáng)身健體的目的。近年來(lái)也有研究者將傳統(tǒng)藥食同源的中藥如天麻[11]、穿心蓮[12]、黃芪[13]、茯苓[14]、車(chē)前草[15]、馬齒莧[16]等與環(huán)磷酰胺結(jié)合使用，這些中藥均能降低環(huán)磷酰胺的毒副作用。但未見(jiàn)冠突散囊菌對(duì)經(jīng)環(huán)磷酰胺干預(yù)的小鼠機(jī)體免疫功能影響的相關(guān)報(bào)道。研究擬用環(huán)磷酰胺干預(yù)昆明小鼠，建立免疫抑制模型，再用冠突散囊菌發(fā)酵液灌胃治療小鼠，考察冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)模型小鼠免疫指標(biāo)的影響，以期為茯磚茶的保健作用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茯磚茶：金湘益牌茯磚茶(2009年)，湖南益陽(yáng)茶廠；

環(huán)磷酰胺：批號(hào)Q1547，上海躍騰生物技術(shù)有限公司；

雄性昆明小白鼠：體重(20±1) g，湖南斯萊克景達(dá)試驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

鼠顆粒飼料：湖南斯萊克景達(dá)試驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

IL-2 Elisa試劑盒：上海通蔚生物科技有限公司；

綿羊紅細(xì)胞、豚鼠血清：北京博爾西科技有限公司；

印度墨汁：上海信帆科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

霉菌培養(yǎng)箱：MJ-150(F)-I型，上海一恒科技有限公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：7230G型，上海佑科儀器儀表有限公司；

全自動(dòng)五分類(lèi)血液細(xì)胞分析儀：BC-6000型，深圳開(kāi)立生物醫(yī)療科技股份有限公司；

酶標(biāo)儀：WD-2103A型，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冠突散囊菌的分離純化 根據(jù)文獻(xiàn)[17]方法，并稍作修改。取25 g茯磚茶置于225 mL滅菌生理鹽水中，振蕩5 min，得到1∶10的樣品液。采用稀釋涂布法，將樣品稀釋液涂布于察氏培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。采用平板劃線法進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌的分離純化，再挑取單菌落接種于斜面上，恒溫培養(yǎng)(28 ℃)，繼代3～4次后，獲得純化菌株，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 冠突散囊菌發(fā)酵液的制備 將冠突散囊菌接入M40Y液體培養(yǎng)基，恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液放入組織破碎機(jī)中進(jìn)行勻漿處理，即得質(zhì)量濃度為21.2 mg/mL冠突散囊菌發(fā)酵液原液。將原液(21.2 mg/mL)用無(wú)菌蒸餾水分別稀釋2倍和4倍，得到冠突散囊菌中劑量組發(fā)酵液(10.6 mg/mL)和低劑量組發(fā)酵液(5.3 mg/mL)，4 ℃冰箱貯藏備用。

1.3.3 動(dòng)物造模與分組 將小鼠置于溫度20～25 ℃，濕度40%～70%的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，待小鼠適應(yīng)環(huán)境后方可開(kāi)展試驗(yàn)。取30只昆明小鼠編號(hào)稱(chēng)重，隨機(jī)分成5組每組6只，分別是正常組、對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。飼養(yǎng)前3 d，分別給各組小鼠(除正常組外)腹腔注射劑量為80 mg/kg的環(huán)磷酰胺0.2 mL，建立低免疫力模型。正常組小鼠則腹腔注射0.2 mL生理鹽水作為空白對(duì)照。第4～18天，低、中、高劑量組小鼠分別灌胃0.4 mL相應(yīng)溶液，對(duì)照組和正常組則灌胃等體積無(wú)菌蒸餾水，每天一次，試驗(yàn)期間各組小鼠自由飲水和采食。

1.3.4 脾臟指數(shù)測(cè)定 在最后一次給藥24 h，小鼠經(jīng)稱(chēng)重后，頸椎脫臼處死小鼠，立即解剖并摘取完整的脾臟組織。濾紙吸干脾臟表面的血污，稱(chēng)量脾臟組織重量，按式(1)計(jì)算脾臟指數(shù)。

(1)

式中：

Si——脾臟指數(shù)，mg/g；

m1——脾臟重量，mg；

m2——體重，g。

1.3.5 單核—巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的測(cè)定 每組6只小鼠末次灌胃24 h后，從尾靜脈注入用生理鹽水稀釋3倍的印度墨汁，劑量0.1 mL/10 g。分別于注入墨汁后的第2 min和第10 min，取20 μL內(nèi)眥靜脈血至2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。使用分光光度計(jì)在600 nm下測(cè)量光密度值，用Na2CO3溶液作為空白對(duì)照。按式(2)和式(3)計(jì)算廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)：

(2)

式中：

K——廓清指數(shù)；

D600 nm，2 min——注射后2 min所取血樣光密度；

D600 nm，10 min——注射后10 min所取血樣光密度；

Δt——兩次取血樣的時(shí)間差，min。

(3)

式中：

α——吞噬系數(shù)；

m1——脾臟重量，g；

m2——體重，g；

m3——肝臟重量，g；

K——廓清指數(shù)。

1.3.6 半數(shù)溶血值的測(cè)定 用無(wú)菌生理鹽水配制體積分?jǐn)?shù)為2%的綿羊紅細(xì)胞溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。末次灌胃1 h后，各組小鼠分別腹腔注射2%的綿羊紅細(xì)胞0.2 mL，并繼續(xù)正常飼養(yǎng)4 d。然后摘取眼球血1 mL于EP管內(nèi)，室溫放置1 h后，低速離心(2 000 r/min，10 mim)以采集血清。用生理鹽水稀釋血清200倍，取1 mL血清稀釋液置于試管內(nèi)。依次加入體積分?jǐn)?shù)10%的綿羊紅細(xì)胞溶液0.5 mL，補(bǔ)體1 mL。另設(shè)對(duì)照組，用生理鹽水代替血清。各組均放入恒溫水浴鍋(37 ℃)溫育10 min后，放入冰浴終止反應(yīng)。低速離心并取1 mL上清加入體積分?jǐn)?shù)10%的綿羊紅細(xì)胞溶液0.25 mL，然后滴加都氏試劑(碳酸氫鈉1.0 g，高鐵氰化鉀0.2 g，氰化鉀0.05 g，加蒸餾水至1 000 mL)至4 mL，充分混勻后靜置10 min。在450 nm處，以對(duì)照管作空白，分別測(cè)定各管光密度值。

(4)

式中：

Hhv——半數(shù)溶血值；

D450 nm，1——樣本光密度值；

D450 nm，2——SRBC半溶血時(shí)的光密度值；

d——稀釋倍數(shù)。

1.3.7 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)檢測(cè) 足趾增厚法。用0.2 mL體積分?jǐn)?shù)2%的綿羊紅細(xì)胞溶液腹腔注射各組小鼠，使小鼠致敏。4 d后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量左后足足趾部厚度，每個(gè)樣本在同一位置測(cè)量3次并取平均值。在測(cè)量部位皮下注射體積分?jǐn)?shù)20%的綿羊紅細(xì)胞溶液20 μL，并在24 h后測(cè)量3次小鼠的左后足足趾部厚度，計(jì)算3次平均值。DTH的水平用兩次測(cè)量值的平均厚度差表示。

1.3.8 血清中白介素-2(IL-2)質(zhì)量濃度的檢測(cè) 最后一次灌胃24 h后，各組小鼠用1.5 mL離心管收集眼球血，37 ℃溫箱30 min，使血清充分析出，冷凍離心(3 000 r/min)10 min。收集上層血清，用ELISA法[18]檢測(cè)IL-2的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)Dunken的分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并以不同小寫(xiě)字母進(jìn)行標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠的臨床表現(xiàn)

正常組小鼠，表現(xiàn)好動(dòng)，抓尾反抗力強(qiáng)，毛色正常順滑，無(wú)明顯可見(jiàn)的臨床癥狀。造模期間，經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺后的小鼠，表現(xiàn)較為平靜，活動(dòng)減少，抓尾反抗力減弱，毛發(fā)稀疏蓬松，有比較嚴(yán)重的掉毛現(xiàn)象。用冠突散囊菌發(fā)酵液灌胃治療后，小鼠的活動(dòng)強(qiáng)度、抓尾反抗力及毛發(fā)狀態(tài)均有所好轉(zhuǎn)，而且部分小鼠基本恢復(fù)正常。

2.2 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響

由圖1可知，與正常組相比，對(duì)照組脾臟指數(shù)顯著上升。經(jīng)不同劑量的冠突散囊菌發(fā)酵液治療后，中劑量組小鼠的脾臟指數(shù)呈上升趨勢(shì)，而低劑量組和高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，仍明顯高于正常組(P<0.05)。

圖1 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響

Zhang等[19]證實(shí)環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠具有生物學(xué)毒性，尤其對(duì)免疫功能造成很大刺激，能顯著降低小鼠的脾臟指數(shù)。而試驗(yàn)中僅用環(huán)磷酰胺刺激小鼠3 d，便停止了刺激，造成小鼠的脾臟指數(shù)在檢測(cè)時(shí)呈現(xiàn)出免疫抵抗而上升的現(xiàn)象，可能是在冠突散囊菌發(fā)酵液的作用下，機(jī)體產(chǎn)生了免疫抑制抵抗，因而脾臟指數(shù)有上升的趨勢(shì)。這與顏愛(ài)等[20]報(bào)道的短時(shí)間環(huán)磷酰胺刺激使脾臟出現(xiàn)“反彈”的現(xiàn)象一致。而小鼠在冠突散囊菌發(fā)酵液的治療下，各劑量組均能達(dá)到提高脾臟指數(shù)的目的，且各劑量組的功效差異并不顯著。

2.3 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠單核—巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響

由圖2可知，對(duì)照組小鼠的單核—巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著低于正常組(P<0.01)，說(shuō)明環(huán)磷酰胺能抑制小鼠的單核—巨噬細(xì)胞吞噬能力，但經(jīng)不同劑量的冠突散囊菌發(fā)酵液治療后，仍無(wú)顯著變化(P>0.05)，提示冠突散囊菌發(fā)酵液可能對(duì)單核—巨噬細(xì)胞的吞噬能力無(wú)明顯作用，可能是冠突散囊菌發(fā)酵液成分較復(fù)雜，對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力整體影響不大。

圖2 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠單核—巨噬細(xì)胞

2.4 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響

由圖3可知，腹腔注射環(huán)磷酰胺后，小鼠的HC50顯著低于正常組，說(shuō)明在環(huán)磷酰胺的刺激下，B淋巴細(xì)胞分泌抗體的能力降低。但經(jīng)不同劑量的冠突散囊菌發(fā)酵液治療后，小鼠的HC50呈劑量依賴(lài)性上升趨勢(shì)，且各治療組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中中、高劑量組小鼠的HC50分別是對(duì)照組的1.26，1.33倍，而且與正常組無(wú)明顯差異。說(shuō)明冠突散囊菌發(fā)酵液有助于B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，增強(qiáng)體液免疫。

圖3 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠半數(shù)溶血值的影響

2.5 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

由圖4可知，經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺的小鼠，其足趾厚度差顯著低于正常組，表明環(huán)磷酰胺顯著抑制正常小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(P<0.05)。與對(duì)照組相比，各劑量組小鼠DTH呈量效性上升，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中中、高劑量組小鼠的DTH與正常組差異并不顯著，提示冠突散囊菌各劑量均能消除環(huán)磷酰胺的抑制作用，且能在動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，使小鼠的細(xì)胞免疫恢復(fù)正常值。這與劉龍龍等[21]發(fā)現(xiàn)的藍(lán)莓酸性提取物在正常范圍內(nèi)能提高小鼠的脾臟指數(shù)和遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的結(jié)果類(lèi)似。說(shuō)明冠突散囊菌發(fā)酵液具有增強(qiáng)小鼠自身細(xì)胞免疫的功能。

圖4 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

2.6 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠血清中IL-2質(zhì)量濃度的影響

IL-2主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體免疫功能中發(fā)揮著重要作用。IL-2 能刺激T細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)單核—巨噬細(xì)胞的抗原遞呈能力、殺菌能力、細(xì)胞毒性作用；直接作用于B細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞的增值、分化和抗體分泌；激發(fā)自然殺傷細(xì)胞和毒性T細(xì)胞的殺傷力。由圖5可知，對(duì)照組小鼠血清中IL-2的質(zhì)量濃度與正常組相比有所下降，但并未達(dá)到顯著性水平。而低、中、高劑量組小鼠血清中IL-2的質(zhì)量濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，分別為正常組的3.07，3.10，2.87倍。IL-2的高表達(dá)能刺激機(jī)體免疫細(xì)胞的增值、分化和抗體的分泌，因此，冠突散囊菌發(fā)酵液刺激T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2來(lái)增強(qiáng)免疫低下小鼠的免疫功能。

圖5 冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠血清中IL-2質(zhì)量濃度的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)從茯磚茶中分離純化冠突散囊菌，考察了冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)免疫抑制小鼠免疫指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，冠突散囊菌發(fā)酵液可通過(guò)促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，激活T淋巴細(xì)胞功能，刺激T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2來(lái)增強(qiáng)小鼠免疫功能。但由于冠突散囊菌發(fā)酵液的成分暫不清晰，菌體成分或代謝產(chǎn)物等還需進(jìn)一步分離純化，后續(xù)將繼續(xù)探究發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物、多糖等具體成分的作用，以更全面、更深層次地揭示茯磚茶生理功能背后的作用機(jī)理。