王興紅 鄧海峰 孫縵利

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,河南 漯河 462000）

目前，糖尿病腎臟疾病是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。槲皮素因具有廣泛的藥理學(xué)作用，現(xiàn)在受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。它是一種天然的黃酮類化合物，其優(yōu)勢(shì)是具有多靶點(diǎn)作用和綜合治療優(yōu)勢(shì)的一個(gè)中藥單體[1]。王天然等（2013）研究表明，槲皮素對(duì)大鼠慢性腎功能衰竭具有一定的防治作用，但是具體的機(jī)制尚未完全闡述清楚[2]。倪彩菊等（2021）研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路廣泛存在于各類生物體內(nèi)，它是一條相對(duì)較保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、遷移和凋亡等系列過(guò)程[3]。Milanesi等（2019）研究表明，Wnt信號(hào)異常激活將導(dǎo)致腫瘤、纖維增生等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，同時(shí)也可調(diào)控誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化及增殖，從而起到改善心肌肥厚的作用[4]。本研究從Wnt/β-catenin/GSK3β信號(hào)通路入手，研究槲皮素對(duì)糖尿病腎臟疾病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物

槲皮素（美國(guó)Sigma，純度≥98%），批號(hào) 190123；驍悉（上海羅氏制藥有限公司），批號(hào)191123。

1.2 動(dòng)物

成年健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重300～350 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（湘）2016－0003］。全部大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素（STZ）由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，純度＞99%；Wnt3a小鼠抗大鼠單克隆抗體（批號(hào)191009）、p-GSK-3β小鼠抗大鼠單克隆抗體（批號(hào)190907）、β-catenin小鼠抗大鼠單克隆抗體（批號(hào)191003）購(gòu)自北京博奧森生物公司。

1.4 儀器

三諾SXT-1型快速血糖測(cè)定儀（長(zhǎng)沙），PowerPac 200電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司），Trans-Blot電泳濕轉(zhuǎn)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物模型的建立與分組

實(shí)驗(yàn)組大鼠一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，以血糖≥16.65 mmol/L為糖尿病大鼠；正常對(duì)照組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、25 mg/kg槲皮素組和50 mg/kg槲皮素組，槲皮素組臨用前用生理鹽水配成10 g/L的槲皮素溶液每日灌胃治療，正常對(duì)照組和糖尿病模型組按體重?fù)Q算等體積的生理鹽水灌胃處理。

1.5.2 標(biāo)本采集與處理

第56 d，各組大鼠均心臟采血備用，并立即處死，剖腹取雙側(cè)腎臟標(biāo)本，用濾紙吸干水分，去包膜，稱重，計(jì)算腎臟肥大指數(shù)（KW/BW，腎臟肥大指數(shù)=雙側(cè)腎質(zhì)量/體質(zhì)量）。

1.5.3 血糖

采用快速血糖測(cè)定儀測(cè)定各組大鼠血糖。

1.5.4 血BUN、Scr及24h尿蛋白測(cè)定

血BUN、Scr用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；24h尿蛋白的含量采用雙縮脲法測(cè)定。

1.5.5 Western blot測(cè)定腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin蛋白的表達(dá)水平

總蛋白含量采用BCA法測(cè)定。蛋白樣品進(jìn)行10%SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉，加入一抗兔抗Wnt3a抗體（1 ∶500）、兔抗p-GSK-3β抗體（1 ∶1 000）和兔抗β-catenin抗體（1 ∶1 000稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次15 min。洗滌后二抗［羊抗小鼠抗體（1 ∶5 000）］孵育，置于搖床上搖動(dòng)，室溫下1 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次15 min；ECL發(fā)光劑暗室曝光成像、拍照，ImageJ軟件分析求得IOD。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），各組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。P＜0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食的癥狀，且毛發(fā)色澤黯淡、精神萎靡、活動(dòng)減少，隨著病程延長(zhǎng)，除大鼠體重呈下降趨勢(shì)外，其他癥狀更加明顯；與糖尿病模型組比較，槲皮素組治療8周后，上述癥狀和體征均得到較明顯改善。

2.2 槲皮素對(duì)糖尿病大鼠血BUN、Scr、24h尿蛋白、腎臟肥大指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠腎臟肥大指數(shù)、血BUN、Scr和24h尿蛋白均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與糖尿病模型組比較，槲皮素組大鼠腎臟肥大指數(shù)、血BUN、Scr和24h尿蛋白顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠血BUN、Scr、24h尿蛋白、腎臟肥大指數(shù)比較（，n=10）

表1 各組大鼠血BUN、Scr、24h尿蛋白、腎臟肥大指數(shù)比較（，n=10）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01（下同）。

2.3 槲皮素對(duì)糖尿病大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與糖尿病模型組比較，槲皮素組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見圖1、表2。

表2 各組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin表達(dá)的比較（，n=10）

表2 各組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin表達(dá)的比較（，n=10）

圖1 各組大鼠腎組織Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)量（Western blot檢測(cè)）

3 討論

糖尿病性腎?。―N）是糖尿病患者最主要的微血管慢性并發(fā)癥之一，目前的治療除了進(jìn)行血液透析，尚無(wú)有效的根治措施。因此，采取有效的措施延緩腎功能的下降是有效預(yù)防DN的重要措施。

Wang等（2018）研究表明，β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，可作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的第二信使[5]。Li（2017）等研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a信號(hào)通路不僅調(diào)控胰島β細(xì)胞的代謝和功能，而且參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展，顯示其在糖尿病中具有越來(lái)越重要的作用[6]。Kang等（2020）實(shí)驗(yàn)證實(shí)白芍總苷對(duì)心肌肥厚大鼠的β-catenin蛋白表達(dá)有顯著劑量依賴性的抑制作用，提示它可能是通過(guò)抑制β-catenin表達(dá)發(fā)揮抗心肌肥厚作用，推測(cè)Baurand實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與心臟成纖維細(xì)胞適度增殖可防止心力衰竭的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，即可能與β-catenin基因敲除組的心臟成纖維細(xì)胞適度增殖相關(guān)[7]。

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，對(duì)冠心病及高血壓患者也有輔助治療作用[8]。課題組前期研究槲皮素可以降低腎組織氧化應(yīng)激水平和增強(qiáng)抗氧化能力，并減少BUN、Scr、24h蛋白尿，發(fā)揮保護(hù)糖尿病腎臟的作用[9]。本研究進(jìn)一步探討了槲皮素對(duì)DN的保護(hù)作用機(jī)制，結(jié)果顯示，糖尿病模型組Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)顯著增高，表明上述蛋白參與了糖尿病腎臟疾病的損害過(guò)程，這與前人的研究結(jié)果是一致的；而經(jīng)過(guò)槲皮素治療8周后，這些參與蛋白均明顯降低，此結(jié)果顯示槲皮素能通過(guò)抑制Wnt3a、p-GSK-3β和β-catenin蛋白的表達(dá)，對(duì)腎組織和腎功能有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，槲皮素對(duì)糖尿病大鼠腎功能的保護(hù)作用機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin/GSK3β信號(hào)通路密切相關(guān)。它能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin/GSK3β信號(hào)通路，避免GSK-3β蛋白的磷酸化，進(jìn)而使β-catenin保持在一個(gè)較低的水平內(nèi)，從而抑制了腎臟的肥大。