姚成碩，尚李華，常 歡，李冠軍，李 鍵

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程與經(jīng)營(yíng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002）

植物內(nèi)生真菌（Endophyte）是指在健康植物組織中具有全部或部分生命周期，不會(huì)對(duì)宿主植物造成明顯病癥的微生物[1]。迄今為止，許多研究已經(jīng)證實(shí)內(nèi)生真菌廣泛存在于植物體內(nèi)[2]。由于內(nèi)生真菌共生于植物體內(nèi)，它們的次生代謝產(chǎn)物更容易影響宿主的生理活動(dòng)，而且許多植物的活性與其內(nèi)生真菌的次生代謝物活性有相似之處，因此受到了廣泛的關(guān)注[3]。早期關(guān)于內(nèi)生真菌的研究多集中在藥用植物[4]，而近年來(lái)在生物菌肥的開(kāi)發(fā)利用方面開(kāi)展了研究工作，取得了比較好的成果：對(duì)鹽堿地[5]、干旱礦區(qū)[6]等不適宜種植作物的土壤進(jìn)行改良、增加土壤微生物的數(shù)量從而提高土壤有機(jī)質(zhì)含量進(jìn)而提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[7]?，F(xiàn)有研究表明，內(nèi)生真菌可以通過(guò)提高植物養(yǎng)分利用效率、產(chǎn)生活性物質(zhì)或產(chǎn)生對(duì)植物有益的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、改善土壤質(zhì)量或改變土壤微生物群落等來(lái)增強(qiáng)宿主植物抗逆性[8-10]。內(nèi)生真菌與宿主植物之間的共生關(guān)系是長(zhǎng)期共同發(fā)育形成的，這些內(nèi)生真菌從宿主植物中吸取所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以完成其生命周期，同時(shí)，內(nèi)生真菌在某些植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用[11]。如甘蔗中分離得到的內(nèi)生固氮醋桿菌（Acetobacter diazotrophicus）對(duì)其宿主植物具有顯著的促生作用[12]，其產(chǎn)生的諸如吲哚乙酸等對(duì)植物生長(zhǎng)起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)能夠加快甘蔗的生長(zhǎng)速度以及提高產(chǎn)量[13]。因此，通過(guò)植物自身與微生物互作來(lái)增強(qiáng)植物的營(yíng)養(yǎng)生理和抗性機(jī)能在森林可持續(xù)經(jīng)營(yíng)中有廣闊的應(yīng)用前景。

短枝木麻黃（Casuarina equisetifolia Forst.）屬木麻黃科（Casuarinaceae）木麻黃屬常綠喬木[14]，具有生長(zhǎng)快、耐旱、耐鹽堿、防風(fēng)固沙等功能[15]，是我國(guó)東南沿海地區(qū)防護(hù)林的主要樹(shù)種[16]，但長(zhǎng)期以來(lái)，木麻黃人工林始終面臨衰退現(xiàn)象和林分更新困難，這主要是由于其生環(huán)境惡劣有關(guān)[17]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),隨著NaCl處理濃度的增加，木麻黃種子的萌發(fā)能力、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)都呈下降趨勢(shì)，發(fā)芽幼苗的早期生長(zhǎng)也受到抑制，且高鹽濃度抑制作用更明顯，表明高鹽含量明顯抑制木麻黃種子及幼苗的生長(zhǎng)，影響了木麻黃的二次更新[18]。如何提高木麻黃幼苗的耐鹽脅迫能力對(duì)東南沿海防護(hù)林的可持續(xù)經(jīng)營(yíng)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。木麻黃內(nèi)生真菌具有數(shù)量多、多樣性豐富、能夠生產(chǎn)具有生物活性的代謝物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)[19]。

課題組前期研究中從短枝木麻黃的小枝分離得到一株耐鹽促生內(nèi)生真菌，其液體發(fā)酵液對(duì)寄主植物表現(xiàn)出良好的促生作用[20]，內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、質(zhì)量控制容易等優(yōu)點(diǎn),有利于規(guī)?；a(chǎn)[21-23]，因此內(nèi)生真菌菌液培養(yǎng)條件的優(yōu)化是菌株開(kāi)發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)，本研究通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的方法，探究不同因素對(duì)其菌絲體液體發(fā)酵的影響，以確定最佳培養(yǎng)條件，研究結(jié)果可為木麻黃內(nèi)生真菌液態(tài)菌劑的開(kāi)發(fā)累積實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為緩解木麻黃在濱海高鹽分地更新困難問(wèn)題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌種

短枝木麻黃內(nèi)生真菌Y6(炭團(tuán)菌屬Hypoxylon sp.)是福建農(nóng)林大學(xué)森林生態(tài)研究所從短枝木麻黃（15 a）小枝中分離得到，現(xiàn)保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏與管理中心，保藏號(hào)（CGMCC No.18814），前期實(shí)驗(yàn)表明其能提高木麻黃耐鹽性[20]。

1.2 培養(yǎng)基

采用改良馬丁培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化和接種制備：蛋白胨2.5 g，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g，蒸餾水500 mL，pH值6.2～6.6。將內(nèi)生真菌在28℃培養(yǎng)7 d，獲得平板菌落，用打孔機(jī)將菌落分成若干小部分，取出瓊脂，接種于同體積的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）50 mL中。將菌株的種子液放入恒溫培養(yǎng)箱在28℃下培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)速160 r/min。

1.3 實(shí)驗(yàn)及分析方法

1.3.1 最佳碳源及其濃度篩選

分別將1%蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、葡萄糖和可溶性淀粉作為培養(yǎng)基的唯一碳源，設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)[24]，以發(fā)酵液的菌絲生物量（OD260）作為衡量指標(biāo)[25]，通過(guò)比較確定最佳碳源。

1.3.2 最佳氮源及其濃度篩選

分別將2%的尿素，NH4Cl，酵母粉，(NH4)2SO4，NH4NO3，蛋白胨作為培養(yǎng)基的唯一氮源，設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)[24]，將發(fā)酵液菌絲生物量（OD260）作為衡量指標(biāo)[25]，通過(guò)多次比較確定最佳氮源。

1.3.3 最佳裝液量、培養(yǎng)基pH值和接種量篩選

根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)選擇最佳碳源和氮源添加到培養(yǎng)基中，將裝液量分別設(shè)置為20、25、30、35、40、45、50 mL；初始pH值分別調(diào)整為pH 5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。接種量分別為1%，3%，5%，7%，10%。每個(gè)條件設(shè)3個(gè)平行[24]，以發(fā)酵液菌絲生物量（OD260）為評(píng)價(jià)指標(biāo)[25]，確定最佳發(fā)酵條件。

1.3.4 最佳發(fā)酵條件的選擇

在碳源和氮源的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇可溶性淀粉濃度、NH4Cl濃度、裝液量、培養(yǎng)基pH、接種量作為測(cè)試因子，并從單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果中選擇3個(gè)最佳數(shù)據(jù)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)[26]，確定最佳發(fā)酵條件。因接種量為10%時(shí)的OD值要明顯高于其他處理，只有1個(gè)最佳數(shù)據(jù)，故不再對(duì)接種量進(jìn)行下一步的正交實(shí)驗(yàn)，最后選擇可溶性淀粉濃度、NH4Cl濃度、裝液量、培養(yǎng)基pH值進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)（表1）。

表1 培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experimental design of culture conditions

1.3.5 方差分析

通過(guò)SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）比較不同處理間的差異[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件篩選結(jié)果

2.1.1 最佳碳源及其濃度篩選

通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最適培養(yǎng)條件的篩選，菌株Y6最佳碳源是可溶性淀粉（圖1 a），可溶性淀粉處理下要顯著高于其他組，蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖四組處理沒(méi)有顯著差異，葡萄糖處理顯著低于其他組（P＜0.05），故可溶性淀粉最佳，蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖次之，葡萄糖最次；以可溶性淀粉作為唯一碳源，進(jìn)一步改變其濃度為0.005、0.008、0.015、0.020、0.025 mol/L，不同碳源濃度之間在顯著性水平為0.05或0.01的情況下都未表現(xiàn)出顯著差異，而濃度為0.008、0.015、0.020 mol/L時(shí)菌絲生長(zhǎng)量要高于其他兩組，故選擇這三組進(jìn)行下一步的發(fā)酵條件優(yōu)化（圖1 b）。

圖1 碳源種類(lèi)和碳源濃度對(duì)Y6菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.1 Effects of carbon source type and carbon source concentration on mycelial growth of Y6

2.1.2 最佳氮源及其濃度篩選

最佳氮源是NH4Cl（圖2 a），從圖中可知在該條件下菌絲生長(zhǎng)量要明顯高于其他組（P＜0.05）。NH4Cl濃度為0.025 mol/L時(shí)菌絲生長(zhǎng)量與其他組有顯著差異（P＜0.01），且顯著低于其他組，氮源濃度0.005 mol/L處理與0.008 mol/L處理對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響未達(dá)到顯著差異（P>0.01），因碳氮源濃度過(guò)低時(shí)不能為菌株生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，故選擇氮源濃度（0.008、0.015、0.020 mol/L）3組進(jìn)行接下來(lái)的正交實(shí)驗(yàn)（圖2 b）。

圖2 氮源種類(lèi)和氮源濃度對(duì)Y6菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.2 Effects of nitrogen source type and nitrogen source concentration on mycelial growth of Y6

2.1.3 最佳裝液量、培養(yǎng)基pH值和接種量篩選

裝液量分別為20、25、30、35、40、45、50 mL進(jìn)行試驗(yàn)，沒(méi)有達(dá)到顯著差異（P＞0.05），通過(guò)前期單因素實(shí)驗(yàn)確定裝液量的三水平選擇為30、40、50 mL；初始pH值對(duì)菌株的生長(zhǎng)有明顯的影響，從pH值從5升到7的過(guò)程中，生長(zhǎng)量增長(zhǎng)緩慢，pH值從7到7.5的變化中生長(zhǎng)量發(fā)生了驟增，當(dāng)pH值為7.5時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到最高，pH值在7.5～8.5范圍內(nèi)沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），可見(jiàn)Y6菌在偏堿性環(huán)境（pH值為7.5～8.5）下更適宜生長(zhǎng)，中性環(huán)境（pH值為7）次之，酸性環(huán)境（pH值為5～6.5）生長(zhǎng)更差；隨著接種量的增加，生長(zhǎng)量逐漸增加，到接種量為10%時(shí)達(dá)到最大，且顯著高于其他四組處理（P＜0.01），由此可確定其為最佳用量（圖3 a、b、c）?；谇懊鎲我蛩貙?shí)驗(yàn)綜合考慮，按10%接種量為確定值，以碳源濃度（0.008、0.015、0.020 mol/L）、氮源濃度（0.008、0.015、0.020 mol/L）、裝液量（30、40、50 mL）和pH值7、8、9作4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 裝液量、pH值和接種量對(duì)Y6菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Fig.3 Effects of liquid medium,pH value and inoculation amount on mycelial growth of Y6

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

由表2可知，不同營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)菌體OD值的影響程度由大到小的順序?yàn)榕囵B(yǎng)基pH值＞氮源濃度＞裝液量＞碳源濃度。正交分析得到的最佳水平組合為A2B3C1D2。在此條件下,發(fā)酵液D（260）值為0.310，菌絲生物量最高。對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析（表3），可知pH值對(duì)菌體培養(yǎng)有極顯著影響（P＜0.01），而其他因素對(duì)菌體培養(yǎng)影響不顯著(P＞0.05)。

表2 液體培養(yǎng)條件的正交設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.2 Orthogonal design results of liquid culture conditions

表3 變量A-D的方差分析結(jié)果Tab.3 ANOVA results of variables A-D

3 結(jié)論與討論

通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)短枝木麻黃菌株Y6的液體培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化，首先采用了單因子實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行最佳碳源和最佳氮源的篩選，確定可溶性淀粉為最佳碳源，NH4Cl為最佳氮源，最后通過(guò)設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)來(lái)考察碳源濃度、氮源濃度、培養(yǎng)基pH、裝液量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響進(jìn)而選擇最佳液體培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化，確定了菌株Y6在可溶性淀粉濃度1.5%，NH4Cl濃度2%，初始pH值8，30 mL裝液量，10%接種量的培養(yǎng)條件下最適宜生長(zhǎng)，此時(shí)的OD值為0.310。

可溶性淀粉作為碳源有利于菌株Y6的生長(zhǎng)，且促進(jìn)生長(zhǎng)的效果比其他碳源更為明顯。在篩選最佳氮源上，發(fā)現(xiàn)銨態(tài)氮源有利于菌株生長(zhǎng)，尤其是NH4Cl，而有機(jī)氮源的效果并不好。在優(yōu)化培養(yǎng)條件方面，發(fā)現(xiàn)相比于微酸環(huán)境菌株Y6更適合在pH值7.5～8.5的偏堿性環(huán)境下生長(zhǎng)，說(shuō)明相對(duì)于酸性脅迫而言其對(duì)堿性脅迫具有更強(qiáng)的耐受性，根據(jù)耐堿性的特點(diǎn)，可將其種植在大面積鹽堿地從而達(dá)到改善生態(tài)、綠化環(huán)境的目的[27]。由于木麻黃長(zhǎng)期生長(zhǎng)在濱海鹽堿地，為適應(yīng)環(huán)境其結(jié)構(gòu)特征發(fā)生了變化，葉片退化故只能通過(guò)小枝進(jìn)行光合作用[28]。植物葉綠體基質(zhì)的pH值在8.0左右，屬于偏堿性的條件，其中的多種酶必須在適宜的pH環(huán)境下才具有最高的活性[29]。本次實(shí)驗(yàn)采用的菌株Y6是從短枝木麻黃小枝分離得到的，菌株Y6適宜在偏堿性環(huán)境中生存，以保證植物的生長(zhǎng)發(fā)育。由于本次實(shí)驗(yàn)所設(shè)的pH值水平梯度有限，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中菌株的生長(zhǎng)情況還有待進(jìn)一步研究。

單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)是大多數(shù)內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)用來(lái)確定最佳培養(yǎng)條件的方法，也有在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用其他技術(shù)來(lái)進(jìn)行優(yōu)化的。液體發(fā)酵過(guò)程中影響因素十分復(fù)雜，不同影響因素之間存在著交互作用，僅僅通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)往往無(wú)法獲得很好的預(yù)期結(jié)果[30]。而采用響應(yīng)曲面法就可以既優(yōu)化影響液體發(fā)酵的因子的交互作用，又簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)次數(shù)[31]。本實(shí)驗(yàn)欠缺一組未優(yōu)化前的培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)照，無(wú)法得知優(yōu)化后生長(zhǎng)量的提高率。本次研究通過(guò)探究菌株Y6最適宜的液體培養(yǎng)條件，為進(jìn)一步的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，但存在著采用的方法較為簡(jiǎn)單、劃分的濃度梯度較低等問(wèn)題，因此如何改善優(yōu)化方法，提高產(chǎn)量是下一步研究的重點(diǎn)。