柴新義，李夢(mèng)宇，于士軍，孫 星，羅 俠，張微微，胡文龍

(1.滁州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000；2.滁州南譙區(qū)大柳鎮(zhèn)鳳勝食用菌生產(chǎn)合作社，安徽 滁州 239000)

1993年，Stierle[1]從短葉紅豆衫中分離出能合成抗癌物質(zhì)的內(nèi)生真菌，由此關(guān)于內(nèi)生真菌及其活性物質(zhì)的研究才真正開展起來(lái)。近年來(lái)，內(nèi)生真菌的次生代謝物在病害和蟲害的生物防治中起到很大作用，可在農(nóng)業(yè)中發(fā)揮重大作用，使植物的生長(zhǎng)免遭病蟲破壞[2-4]。在醫(yī)藥方面，可推進(jìn)抗生素類藥物的研發(fā)，治療各種新型疾病。因此，越來(lái)越多的學(xué)者研究植物內(nèi)生真菌[5-6]。關(guān)于內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的研究主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)方面，如抗癌、抗腫瘤等活性物質(zhì)藥物的研發(fā)[7]。真菌方面在對(duì)紫薯、麻黃、三尖杉、枸杞等植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及發(fā)酵產(chǎn)物的研究中取得了一定的結(jié)果，加速了生物活性物質(zhì)方面的研究進(jìn)展[8-10]。近年來(lái)，對(duì)植物內(nèi)生真菌的研究主要包括裸子植物和被子植物，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌具有活性的菌株可為農(nóng)業(yè)方面及抗性藥物的研發(fā)提供參考依據(jù)[11-12]。

青檀是我國(guó)特有的古老榆科植物，在植物與其內(nèi)生真菌長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，往往已形成了豐富和穩(wěn)定的內(nèi)生真菌菌群，從青檀植物內(nèi)生真菌資源中篩選出高抗氧化活性的菌株具有巨大的潛力。由此，本研究通過(guò)對(duì)青檀內(nèi)生真菌高抗氧化活性菌株的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以期為今后的深入研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供重要參考。該研究不僅有利于保護(hù)我國(guó)稀有的特有野生樹種青檀，而且利于推進(jìn)抗氧化、抗癌和抗腫瘤等生物藥物的研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株分離自安徽瑯琊山內(nèi)我國(guó)特有的野生榆科植物青檀健康的枝條內(nèi)，共30株，由滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨2 g/L，K2HPO43.2 g/L，CuSO46.0×10-3g/L，MgSO40.2 g/L，pH自然。

液體菌種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO43 g/L，VB11.0×10-2g/L，pH自然。

1.1.3 試劑與設(shè)備

二苯代苦味肼基自由基（DPPH），75%乙醇，2%次氯酸鈉，葡萄糖，蔗糖，乳糖，可溶性淀粉，NH4CL2，(NH4)2SO4，蛋白胨，尿素，K2HPO4，CuSO4，KH2PO4，MgSO4，VB1等。

高壓蒸汽滅菌鍋,YXQ-LS-75SII，西安常儀儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)，BBS-SDC，濟(jì)南飛捷醫(yī)療設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，LHS-80SC(H)，上海印溪儀器儀表有限公司；干燥箱，101-3A，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器，DHZ-1112，上海精宏儀器有限公司；電子天平，F(xiàn)A1004，江蘇南京設(shè)備儀器商城；超速離心機(jī)，IEC Multi，美國(guó)熱電集團(tuán)；紫外分光光度計(jì)，752N，上海精科儀電。

1.2 方法

1.2.1 制備菌絲體發(fā)酵粗體液

配制3000 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按每瓶100 mL裝至錐形瓶中，滅菌15 min后在超凈工作臺(tái)中用直徑1 cm的打孔器取供試菌株3塊，接種至錐形瓶中，然后放入轉(zhuǎn)速150 r/min、25℃的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)7 d。隨后，用8層無(wú)菌紗布對(duì)上述培養(yǎng)物進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的液體置轉(zhuǎn)速5000 r/min的離心機(jī)，離心處理20 min，然后用移液槍移取10 mL液體，再用0.45 mm的濾膜過(guò)濾，即可獲得粗提液。

1.2.2 粗提液抗氧化活性的測(cè)定

制備0.065 mmol/L的DPPH自由基溶液，然后取上述離心后的粗提液2 mL，加入1.9 mL的DPPH自由基溶液，將其置于37℃環(huán)境中反應(yīng)30 min，然后再放入離心機(jī)中離心5 min，最后利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品517 nm處的吸光值，設(shè)置空白對(duì)照記為Amax，樣品溶液吸光值記為A0，樣品加DPPH自由基溶液吸光值記為Ai，用公式DPPH=[1-(Ai-A0)/Amax]×100%，計(jì)算自由基的清除率。

1.2.3 制備液體菌種

用馬鈴薯制備液體種子培養(yǎng)基1000 mL。分裝滅菌后，接種具有高抗氧化活性的菌株，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)3～4 d，培養(yǎng)物作為發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化研究的液體菌種。

1.2.4 高抗氧化活性菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

（1）最適碳源的篩選：以液體發(fā)酵基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別選擇乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖為唯一碳源，添加量為20 g/L，接種液體菌種培養(yǎng)基20 mL，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中25℃下，培養(yǎng)7 d，測(cè)定DPPH自由基清除率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

（2）最適氮源的篩選：以液體發(fā)酵基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別選擇蛋白胨、尿素、NH4Cl2、(NH4)2SO4為唯一氮源，添加量為20 g/L，接種液體菌種培養(yǎng)基20 mL，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中25℃下，培養(yǎng)7 d，測(cè)定DPPH自由基清除率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

（3）最適裝液量的確定：在250 mL的錐形瓶中分別裝入80、100、120、140 mL的液體發(fā)酵基本培養(yǎng)基，接種液體菌種培養(yǎng)基20 mL，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中25℃下，培養(yǎng)7 d，測(cè)定DPPH自由基清除率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

（4）最適pH值的確定：以液體發(fā)酵基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別調(diào)節(jié)起始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0，接種液體菌種培養(yǎng)基20 mL，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中25℃下，培養(yǎng)7 d，測(cè)定DPPH自由基清除率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

（5）最適溫度的確定：以液體發(fā)酵基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，接種液體菌種培養(yǎng)基20 mL，放入溫度分別為25、27、29、31℃的恒溫培養(yǎng)振蕩器中，培養(yǎng)7 d，測(cè)定DPPH自由基清除率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

（6）最適培養(yǎng)時(shí)間的確定：以液體發(fā)酵基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，接種液體菌種培養(yǎng)基20 mL，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，分別培養(yǎng)6、8、10、12 d，測(cè)定DPPH自由基清除率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

利用公式DPPH=[1-(Ai-A0)/Amax]×100%計(jì)算自由基的清除率。利用SAS 9.12軟件中GLM模塊進(jìn)行不同處理之間的差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青檀內(nèi)生真菌抗氧化活性菌株的篩選

對(duì)供試的30株青檀枝條內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行DPPH自由基清除率試驗(yàn)，結(jié)果表明：有3株內(nèi)生真菌表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗氧化活性，占供試菌株的10%，菌株CZXY0024的DPPH自由基清除率最高，達(dá)（79.35±0.09）%，且與CZXY0014和CZXY0027兩個(gè)菌株之間的DPPH自由基清除率存在明顯差異（表1）。因此，選擇菌株CZXY0024進(jìn)行高抗氧化活性菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)。

表1 青檀內(nèi)生真菌菌株對(duì)DPPH自由基清除率試驗(yàn)Tab.1 DPPH radical scavenging activity of endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

2.2 高抗氧化活性菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

（1）最適碳源

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同碳源對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在顯著性差異（圖1）。葡萄糖作為碳源時(shí)，DPPH自由基清除率最高，為62.07%?？扇苄缘矸圩鳛樘荚磿r(shí)，DPPH自由基清除率最低，僅為27.32%。因此，選擇葡萄糖作為最佳培養(yǎng)碳源。

圖1 不同碳源對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（2）最適氮源

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同氮源對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在顯著性差異（圖2）。硫酸銨作為氮源時(shí)，DPPH自由基清除率最高，為67.71%。氯化銨作為氮源時(shí)，DPPH自由基清除率最低，僅為37.82%。因此，選擇硫酸銨作為最佳培養(yǎng)氮源。

圖2 不同氮源對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（3）最適裝液量

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同裝液量對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在明顯差異（圖3）。裝液量100 mL時(shí)，DPPH自由基清除率最高，達(dá)70.32%。因此，選擇100 mL/250 mL的裝液量作為最佳培養(yǎng)裝液量。

圖3 不同裝液量對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of different liquid contents on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（4）最適pH值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同起始pH值對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在明顯差異（圖4）。pH值7.0作為起始pH時(shí)，DPPH自由基清除率最高，為56.79%。pH值5.0作為起始pH時(shí)，DPPH自由基清除率最低，僅為27.21%。因此，pH值7.0可作為最適起始pH。

圖4 不同起始pH對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effects of different initial pH on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（5）最適溫度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同發(fā)酵培養(yǎng)溫度對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在明顯差異（圖5）。培養(yǎng)溫度為27℃時(shí)，發(fā)酵粗體液對(duì)DPPH自由基清除率最高，達(dá)59.71%。培養(yǎng)溫度為31℃時(shí)，DPPH自由基清除率最低，僅為29.78%。因此，選擇27℃的發(fā)酵培養(yǎng)溫度作為最適培養(yǎng)溫度。

圖5 不同培養(yǎng)溫度對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effects of different culture temperature on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

（6）最適培養(yǎng)時(shí)間

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵液的DPPH自由基清除率的影響不同，且存在明顯差異（圖6）。培養(yǎng)時(shí)間為8 h時(shí)，發(fā)酵粗體液對(duì)DPPH自由基清除率最高，達(dá)67.61%。培養(yǎng)時(shí)間為6 h時(shí)，DPPH自由基清除率最低（43.54%）。因此，選擇8h作為最適發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。

圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of different culture time on DPPH free radical scavenging efficiency of crude extracts from endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

2.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取最適裝液量、pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)(表2)。

表2 正交試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)表Tab.2 Orthogonal experimental design

正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果表明，影響青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液抗氧化活性的因素大小順序?yàn)椋浩鹗紁H值>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時(shí)間>裝液量。由此可知，起始pH值對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液的DPPH自由基清除率影響最大，其次為培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間，裝液量的影響最小。因此，青檀內(nèi)生真菌高抗氧化活性菌株CZXY0024最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件的組合為：葡萄糖20 g/L、(NH4)2SO42 g/L、K2HPO43.2 g/L、CuSO46×10-3g/L、Mg-SO40.2 g/L、最適裝液量80 mL、pH 7.0、溫度27℃、培養(yǎng)時(shí)間8 d，該培養(yǎng)條件下青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液對(duì)DPPH自由基清除能力最高，達(dá)86.68%（表3）。

表3 不同正交試驗(yàn)組合對(duì)青檀內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液的DPPH自由基清除率的影響Tab.3 Effects of different orthogonal test combinations on DPPH free radical scavenging efficiency of endophytic fungi from Pteroceltis tatarinowii

3 討論與結(jié)論

劉雅莉等[13]對(duì)蒺藜內(nèi)生真菌分別測(cè)定了發(fā)酵液對(duì)DPPH、OH、O2自由基的清除能力，其在21株內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)9株具有氧化活性，占42.86%。高強(qiáng)等[14]發(fā)現(xiàn)，采集自山東泰安的青檀葉片中的球毛殼具有較高的抗氧化活性。張新國(guó)等[15]對(duì)從烏頭、唐松草、車前草等藥用植物中分離出的43株內(nèi)生真菌進(jìn)行了抗氧化活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中6株具有較好的抗氧化活性，占9.84%，且6株內(nèi)生真菌對(duì)OH自由基具有較強(qiáng)的清除率(>50%)。劉洋等[16]研究發(fā)現(xiàn)，5株杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物在體外具有較高的清除DPPH自由基能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)杜仲葉部?jī)?nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率具有劑量依賴性。本研究對(duì)分離自我國(guó)特有榆科植物青檀中的30株內(nèi)生真菌進(jìn)行了抗氧化活性的篩選實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中3株真菌具有較好的抗氧化活性，占供試菌株的10%。由上可見，植物內(nèi)生真菌是可以作為篩選抗氧化活性菌種的重要資源之一。

曹正等[17]對(duì)四種不同靈芝子實(shí)體提取物的抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示DPPH自由基清除率可達(dá)81.88%。劉力等[18]利用從自然發(fā)酵的酸漿水中分離的2株淀粉乳桿菌和阿米塞畢赤氏酵母進(jìn)行發(fā)酵豆腐黃漿水以研究其清除DPPH自由基的能力，結(jié)果顯示在單菌發(fā)酵時(shí)淀粉乳桿菌發(fā)酵黃漿水對(duì)DPPH自由基清除能力沒(méi)有增強(qiáng)作用，而經(jīng)過(guò)阿米塞畢赤氏酵母發(fā)酵的豆腐黃漿水清除DPPH自由基的能力得到一定提高，達(dá)38.49μmol/mL。張?zhí)觳┑萚19]對(duì)一株保加利亞乳桿菌突變菌株UV2-6進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，結(jié)果表明在麥芽糖2%，酵母膏3%，復(fù)合無(wú)機(jī)鹽0.1%，吐溫800.1%，pH值為8.0，接種量3%，42℃培養(yǎng)的條件下，DPPH自由基清除率達(dá)81.46%。而本研究中篩選的青檀內(nèi)生真菌高抗氧化菌株對(duì)DPPH自由基清除率可高達(dá)86.68%。另外，通過(guò)對(duì)青檀內(nèi)生真菌抗氧化活性菌株篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究，有望為今后的生物藥物開發(fā)和生產(chǎn)提供參考。

青檀內(nèi)生真菌菌株CZXY0024的最優(yōu)生產(chǎn)組合為：葡萄糖20 g/L、(NH4)2SO42 g/L、K2HPO43.2 g/L、CuSO46×10-3g/L、MgSO40.2 g/L、最適裝液量80 mL/250 mL、pH 7.0、溫度27℃、培養(yǎng)時(shí)間8 d，該條件下發(fā)酵粗提液對(duì)DPPH自由基清除能力最高，可達(dá)86.68%。