李榮華， 陳 磊， 武慧娟， 王樹艷， 姜海軍

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 血管普外科，河北 承德 067000

下肢靜脈曲張(varicose veins of lower extremity，VVLE)是指淺表靜脈過度擴(kuò)張、迂曲，產(chǎn)生下肢酸痛、腫脹等臨床癥狀的皮膚微循環(huán)障礙綜合征。髂靜脈壓迫綜合征是VVLE中的一種，隨著年齡的增長，其發(fā)病率明顯升高，嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量[1]。目前，臨床對于VVLE的治療方式主要以靜脈內(nèi)血管硬化術(shù)、經(jīng)皮靜脈生物瓣膜植入術(shù)及射頻治療為主，但復(fù)發(fā)率高，難以根治。臨床主要以大隱靜脈曲張較多見，但對于其具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來，有研究認(rèn)為，靜脈曲張可能與血管重塑有關(guān)[2]。大隱靜脈管壁中含有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)和血管平滑肌，分別發(fā)揮血管擴(kuò)張和收縮的功能，從而維持血管完整性。血管重塑即為細(xì)胞外基質(zhì)和血管平滑肌發(fā)生結(jié)構(gòu)性改變?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶家族，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissueinhibitors of matrix metalloproteinases，TIMP)是MMP相關(guān)性抑制劑，與MMP共同調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝[3]。正常組織中，MMP表達(dá)量很少甚至不表達(dá)，但當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)下，MMP表達(dá)量增加。因此，有學(xué)者認(rèn)為，MMP、TIMP參加血管生長、發(fā)育和血管重塑等多個過程[4-5]。MMP-13作為MMP家族一員，能夠顯著降解膠原的三螺旋區(qū)[6]；TIMP-2作為TIMP家族的代表成員，參與血管重塑過程；c-fos與MMP合成有關(guān)，有學(xué)者推斷c-fos基因參與調(diào)控血管擴(kuò)張和收縮[7]。本研究通過免疫組織化學(xué)法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測VVLE患者的MMP-13、TIMP-2和c-fos蛋白的表達(dá)情況，通過Pearson相關(guān)性分析，明確以上各蛋白對VVLE診斷的意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2017年12月至2018年12月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的200例合并髂靜脈狹窄的VVLE患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在髂靜脈狹窄；(2)術(shù)前3個月無激素使用史；(3)從未進(jìn)行過抗凝治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)單純VVLE或其他靜脈曲張類型疾??；(2)具有深靜脈血栓；(3)不愿意手術(shù)；(4)有重大臟器手術(shù)史、精神障礙史；(5)對造影劑過敏。所有患者均通過下肢深靜脈順行造影確定，根據(jù)髂總靜脈狹窄程度進(jìn)行分類，其中，輕度組(n=67)不進(jìn)行手術(shù)干預(yù)，中度組(n=88)、重度組(n=45)進(jìn)行腔內(nèi)治療。合并髂靜脈狹窄的VVLE評判標(biāo)準(zhǔn)[8]：輕度組，患者髂總靜脈順暢，僅見單純盆腔側(cè)枝存在狹窄，狹窄率<50%；中度組，患者髂總靜脈血流基本通暢，但可見左髂內(nèi)靜脈或其他盆腔粗大側(cè)枝存在狹窄，狹窄率50%～70%；重度組，髂總靜脈存在明顯狹窄或中斷，且伴有盆腔側(cè)枝靜脈存在狹窄，狹窄率≥70%。另選取同期于我院體檢中心進(jìn)行體檢的50 例健康者作為健康組，無精神疾病，無VVLE病史。健康組中，男性35例，女性15例；平均年齡(50.34±6.09)歲。輕度組中，男性45例，女性22例；平均年齡(51.25±6.18)歲。中度組中，男性53例，女性35例；平均年齡(52.52±6.26)歲。重度組中，男性31例，女性14例；平均年齡(51.48±6.16)歲。各組研究對象的一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表達(dá)水平檢測 采用免疫組織化學(xué)法檢測MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表達(dá)水平。(1)試劑與儀器：兔抗人MMP-13、兔抗人TIMP-2 、兔抗人c-fos多克隆抗體，DAB顯色劑，各蛋白的免疫組織化學(xué)檢測試劑盒均購自Abcam公司；甲醇、磷酸鹽緩沖液等試劑均由醫(yī)院購買，采用國產(chǎn)分析純級。(2)實(shí)驗(yàn)操作步驟：術(shù)中采取大隱靜脈的組織標(biāo)本放入冰中，隨后放入冰箱，次日取出組織用10%甲醛固定1 d，然后用不同濃度乙醇脫水過夜、透明，次日用石蠟包埋，切成4 μm厚的切片并進(jìn)行編號，放入盒中備用。選用不同蛋白的免疫組織化學(xué)試劑盒按照按說明方法檢測樣本中MMP-13、TIMP-2、c-fos的表達(dá)含量，然后用DAB顯色劑對組織進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表達(dá)情況。(3)樣本免疫組織化學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)：MMP-13、TIMP-2的細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色的顆粒狀為陽性染色，c-fos細(xì)胞核呈棕黃色為陽性染色。隨機(jī)選取10個高倍鏡視野計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)目，其中，陽性細(xì)胞數(shù)目≤25%為陰性，25%～50%為弱陽性，50%～75% 為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)目>75%為強(qiáng)陽性。

陽性率=[弱陽性數(shù)(+)+陽性數(shù)(++)+強(qiáng)陽性數(shù)(+++)]/總數(shù)×100%

1.2.2 MMP-13 mRNA、TIMP-2 mRNA、c-fos mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR檢測MMP-13mRNA、TIMP-2 mRNA、c-fos mRNA表達(dá)情況。根據(jù)Trizol試劑盒的說明書對術(shù)中標(biāo)本進(jìn)行提取(所有步驟在超凈臺內(nèi)，并在冰上操作完成)。RT-PCR反應(yīng)按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備，cDNA反應(yīng)液的配制如下：反應(yīng)體積20 μl，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃循環(huán)。取出cDNA產(chǎn)物，用DEPC水稀釋5倍，再進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)液的配制如下：反應(yīng)體積15 μl，反應(yīng)條件為94℃ 預(yù)變性4 min；循環(huán)體系94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，循環(huán)30次，72℃延伸10 min。各蛋白引物設(shè)計(jì)如下。β-actin：F:5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，R:5′-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3′；MMP-13：F:5′-AAATTATGGAGGAGATGCCCA TT-3′，R:5′-TCCTTGGAGTGGTCAAGACCTAA-3′；TIMP-2：F:5′-GAGCCTGAACCACAGGTACCA-3′，R:5′-AGGAGATGTAGCACGGGATCA-3′，c-fos：F5′-GGCAGAAGGGGCAAAGTAGA-3′，R 5′-GTTGATCTGTCTCCGCTTGG-3′。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表達(dá)陽性率比較 健康組MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表達(dá)陽性率均低于輕度組、中度組及重度組，且隨著VVLE病情的加重，MMP-13、TIMP-2、c-fos蛋白表達(dá)陽性率均逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1～3。

表1 各組研究對象MMP-13蛋白表達(dá)陽性率比較

表2 各組研究對象TIMP-2蛋白表達(dá)陽性率比較

表3 各組研究對象c-fos蛋白表達(dá)陽性率比較

2.2 各組研究對象TIMP-2 mRNA、MMP-13 mRNA、c-fos mRNA表達(dá)水平比較 健康組TIMP-2 mRNA、MMP-13 mRNA、c-fos mRNA表達(dá)水平均低于輕度組、中度組及重度組，且隨著VVLE的病情加重，TIMP-2 mRNA、MMP-13mRNA、c-fos mRNA表達(dá)水平均逐漸增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組研究對象TIMP-2 mRNA、MMP-13 mRNA、c-fos mRNA表達(dá)水平比較

2.3 相關(guān)性分析 TIMP-2蛋白表達(dá)與VVLE狹窄程度無相關(guān)性(r=0.126，P>0.05)；MMP-13、c-fos蛋白表達(dá)與VVLE狹窄程度呈正相關(guān)(r=0.210、0.139，P<0.05)。

3 討論

靜脈曲張可致皮膚內(nèi)毛細(xì)血管壓力增高、血液成分滲出，進(jìn)而引起皮膚軟組織代謝功能障礙，色素沉著、皮膚萎縮、潰瘍等，是外科常見疾病，多以下肢大隱靜脈為主，該病發(fā)病率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[9]。潰瘍和出血是慢性靜脈疾病的并發(fā)癥，一般無致命危害，但少數(shù)會發(fā)生出血，威脅患者生命安全[10]。對于靜脈曲張的治療一直有不同爭議，輕癥患者多采用保守治療，中、重度患者建議采用手術(shù)治療[11]。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的迅猛發(fā)展，VVLE的手術(shù)治療方法越來越多，但關(guān)于靜脈曲張發(fā)病機(jī)制的研究尚不充足。

有學(xué)者認(rèn)為，血管重塑是靜脈曲張的病理基礎(chǔ)[12]。還有學(xué)者認(rèn)為，靜脈曲張的發(fā)生機(jī)制有多種，一是隨著年齡增加，靜脈壁失去彈性；二是靜脈瓣膜缺失或功能障礙；三是肌肉泵系統(tǒng)功能障礙，靜脈系統(tǒng)阻塞；以上綜合原因?qū)е铝讼轮o脈高壓和靜脈擴(kuò)張，進(jìn)而引起靜脈曲張[13]。正常靜脈壁由外膜、中膜和內(nèi)膜組成。內(nèi)膜主要由彈性蛋白、膠原和蛋白多糖細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)組成，以支持靜脈的彈性回縮。內(nèi)膜層還包含瓣膜，以保持血液以單一向上的方向流向心臟[14]。

MMP共有24個家族成員，是一類催化ECM蛋白降解的中性內(nèi)肽酶，可能影響血管舒張、血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖[15]。MMP活性可被4種不同的TIMP抑制，通過平衡MMP和TIMP的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)這種平衡被破壞時，MMP活性失調(diào)就會導(dǎo)致許多疾病，如癌癥、自身免疫性疾病、心血管疾病和關(guān)節(jié)炎[16]。近年來，MMP和TIMP在血管重塑中的作用越來越被大家接受[17]。本研究結(jié)果顯示，隨著VVLE病情加劇，MMP-13、TIMP-2的表達(dá)顯著增加，說明在靜脈曲張的病程發(fā)展過程中，血管外基質(zhì)明顯被降解破壞；但通過進(jìn)一步的mRNA表達(dá)的半定量檢測發(fā)現(xiàn)，MMP-13和TIMP-2均升高，且隨著病情嚴(yán)重程度的加重而增加。Beidler等[18]研究檢測靜脈曲張潰瘍患者皮損中的MMP-13、MMP-12高于正常組織，且潰瘍愈合程度越高，MMP-13水平越低，說明靜脈曲張潰瘍皮損中的MMP-13上調(diào)將抑制其愈合。本研究結(jié)果顯示，c-fos蛋白表達(dá)明顯增加，趨勢與MMP-13一致。Pan等[19]研究報(bào)道，c-fos表達(dá)促進(jìn)MMP-9和MMP-2的表達(dá)。最后，本研究進(jìn)行了MMP-13和TIMP-2、c-fos表達(dá)與VVLE病情相關(guān)性的研究，結(jié)果表明，MMP-13、c-fos表達(dá)與VVLE狹窄程度呈正相關(guān)。

綜上所述，MMP-13、c-fos蛋白表達(dá)與VVLE病情嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，對VVLE的診斷具有重要意義。