徐 瑩， 任 雪， 姜 曈， 呂東陽(yáng)， 高寬科， 王海旭， 閻 英

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 放療科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

寒冷是一種復(fù)雜、特殊的環(huán)境，長(zhǎng)期暴露于寒冷環(huán)境可致機(jī)體多器官功能紊亂。持續(xù)暴露于低溫環(huán)境時(shí)，核心體溫降低常引起全身凍傷(凍僵)，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及骨關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害，甚至威脅生命。寒冷環(huán)境下遭受輻射可形成“凍-放射復(fù)合傷”。目前，國(guó)內(nèi)外尚缺乏“凍-放射復(fù)合傷”相關(guān)的機(jī)制及救治方案研究，亟需建立動(dòng)物模型進(jìn)行基礎(chǔ)理論探索。本研究通過(guò)模擬寒區(qū)輻射現(xiàn)場(chǎng)，建立“凍-放射復(fù)合傷”動(dòng)物模型，觀察復(fù)合傷中肺損傷情況，旨在探討肺損傷的致傷機(jī)制，為制定“凍-放射復(fù)合傷”應(yīng)急預(yù)案和救治流程提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 40只6～8周齡雄性SD大鼠購(gòu)自本溪長(zhǎng)生生物科技有限公司。所用放射治療設(shè)備為SIEMENS直線加速器。白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自酶科生物公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，MDA5、SOD-25).、Cytochrome C、Bax、Bcl-2抗體以及Ahsg/RAGE/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將40只雄性大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、寒冷組、放射組和凍-放射組，每組各10只。將大鼠每天置于人工氣候箱內(nèi)6 h，箱內(nèi)溫度調(diào)至-10℃，6 h后置于22℃～24℃的室溫環(huán)境，共持續(xù)7 d，第8天接受20 Gy X射線全身單次照射(6 MV-X線，劑量率為220 cGy/min，SSD 100 cm)。

1.2.2 一般癥狀觀察 觀察大鼠一般狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)、皮毛光澤度、活動(dòng)能力、飲食、體質(zhì)量、呼吸、排泄物性狀 。

1.2.3 組織學(xué)觀察 照射后72 h處死所有大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集，收集肺組織標(biāo)本，置于10%中性甲醛溶液中充分固定，然后取材、包埋、切片、HE染色，最后于光學(xué)顯微鏡下攝片觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 血液分析檢測(cè) 于照射后72 h采集血標(biāo)本，送至本溪長(zhǎng)生生物科技有限公司進(jìn)行血液分析化驗(yàn)，檢測(cè)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、血紅蛋白水平。

1.2.5 血?dú)夥治?照射72 h后采集腹主動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治鰴z測(cè)，測(cè)量動(dòng)脈pH值、二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)及動(dòng)脈氧分壓(arterial partial pressure of oxygen ，PaO2)。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法 采血3 000 g離心10 min，收集上清并凍存在-80℃冰箱中備用。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)大鼠血清中IL-1、TGF-β的表達(dá)水平。

1.2.7 肺濕重/干重比值 用濾紙干燥右肺上葉，用天平測(cè)量肺濕重。右肺上葉隨后在60℃的烘箱中干燥72 h，記錄干重。計(jì)算濕重/干重比值提示水腫形成情況。

1.2.8 蛋白免疫印跡法 采用蛋白提取試劑盒提取大鼠肺標(biāo)本蛋白，應(yīng)用BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，檢測(cè)凋亡相關(guān)因子Cytochrome C、Bax 和Bcl-2的表達(dá)；檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白MDA5和SOD-2的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)Ahsg/RAGE/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài)觀察結(jié)果比較 對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量逐漸增加，呼吸平穩(wěn)，便質(zhì)正常。寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠一般狀態(tài)較差，拱背蜷縮，扎堆，呼吸急促，進(jìn)食差，體質(zhì)量減輕。放射組和凍-放射組大鼠出現(xiàn)腹瀉、脫毛、鼻黏膜出血等癥狀。與對(duì)照組比較，放射組、凍-放射組大鼠體質(zhì)量明顯降低，且凍-放射組低于放射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況

2.2 各組大鼠血液分析結(jié)果比較 與對(duì)照組比較，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，放射組和凍-放射組大鼠血紅蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠血象變化情況(a.各組大鼠白細(xì)胞水平；b.各組大鼠淋巴細(xì)胞水平；c.各組大鼠血紅蛋白水平；d.各組大鼠血小板水平)

2.3 各組大鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較 與對(duì)照組比較，放射組、凍-放射組大鼠的pH值明顯降低，PaCO2明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果

2.4 各組大鼠炎性因子表達(dá)水平比較 寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠血清中IL-1、TGF-β表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，且凍-放射組高于寒冷組和放射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠炎性因子表達(dá)水平比較(a.各組大鼠IL-1表達(dá)水平；b.各組大鼠TGF-β表達(dá)水平)

2.5 各組大鼠肺水腫情況比較 與對(duì)照組比較，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺重量/體質(zhì)量比值和濕重/干重比值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠肺水腫情況比較(a.各組大鼠肺重量/體質(zhì)量比值；b.各組大鼠濕重/干重比值)

2.6 各組大鼠肺損傷情況比較 組織病理學(xué)分析顯示，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠均出現(xiàn)了肺損傷改變，其特征是肺體積增大，有明顯的出血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中，凍-放射組織肺組織損傷最為明顯。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠肺損傷情況比較(a.對(duì)照組；b.寒冷組；c.放射組；d.凍-放射組)

2.7 各組大鼠MDA5、SOD-2表達(dá)情況比較 與對(duì)照組比較，寒冷組、放射組、凍放射組MDA5表達(dá)升高，SOD-2的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與寒冷組比較，放射組、凍-放射組MDA5表達(dá)升高，SOD-2表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組大鼠MDA5、SOD-2表達(dá)情況比較

2.8 各組大鼠肺組織凋亡相關(guān)因子水平比較 與對(duì)照組比較，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺組織Cytochrome C、Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與寒冷組比較，放射組和凍-放射組大鼠肺組織Cytochrome C、Bax表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 各組大鼠肺組織凋亡相關(guān)因子水平比較

2.9 各組大鼠Ahsg/RAGE/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況比較 與對(duì)照組比較，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺組織的Ahsg、RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與寒冷組和放射組比較，凍-放射組大鼠肺組織的Ahsg/RAGE/NF-κB蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖8。

圖8 各組大鼠Ahsg、RAGE、NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況比較

3 討論

我國(guó)北部地區(qū)多地域均處于寒區(qū)，在寒冷環(huán)境下遭受核輻射可形成“凍-放射復(fù)合傷”，研究?jī)?放射復(fù)合傷對(duì)特殊條件下衛(wèi)生保障具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)放射的大鼠一般狀態(tài)較差，出現(xiàn)拱背蜷縮、扎堆、進(jìn)食差、體質(zhì)量減輕、腹瀉、脫毛、鼻黏膜出血等癥狀，全血中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞明顯降低，血清中IL-1和TGF-β明顯升高。有研究表明，寒冷應(yīng)激或輻射暴露可導(dǎo)致如IL-1、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α、TGF-β等炎癥介質(zhì)釋放[1-3]。

肺是對(duì)寒冷應(yīng)激反應(yīng)十分明顯的器官，主要表現(xiàn)為不能自主的過(guò)渡通氣，肺通氣量提高8倍，但肺內(nèi)氧彌散量和氧合效果均明顯下降[4]。同時(shí)，肺也是對(duì)放射線最敏感的器官之一，一旦輻射劑量超過(guò)輻射閾值，放射性損傷超出肺組織固有的修復(fù)能力時(shí)，便發(fā)生肺損傷。本研究通過(guò)組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，寒冷組、放射組、凍-放射組大鼠肺部主要病理變化表現(xiàn)為以中性粒細(xì)胞聚集的肺部炎性反應(yīng)，肺泡-毛細(xì)血管膜通透性增加導(dǎo)致肺組織水腫，肺泡內(nèi)透明膜形成，以及由于血管內(nèi)皮受損導(dǎo)致的血栓形成和出血。本研究中，凍-放射組肺泡間隔水腫明顯，可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見(jiàn)肺泡間隔出血等病理變化。為了解這些病理改變對(duì)大鼠肺氣血交換功能的影響，本研究在造模后72 h抽取大鼠動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，寒冷組pH值、PaO2、PaCO2與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，原因可能為本研究大鼠于第1～7天置于寒冷環(huán)境，然后在常溫環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)4 d后處死，可能此時(shí)大鼠的呼吸功能有所恢復(fù)。與對(duì)照組比較，放射組和凍-放射組大鼠的pH值明顯降低，PaCO2明顯增高，而PaO2有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示放射組、凍-放射組大鼠肺部損傷較重，最終導(dǎo)致了血氧交換功能受損傷。

目前，尚不清楚凍-放射復(fù)合傷的機(jī)制。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是肺損傷發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素[5-9]。有研究表明，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，通過(guò)清除中性粒細(xì)胞、補(bǔ)體或聯(lián)合超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶進(jìn)行全身治療，可以預(yù)防急性肺損傷[10-11]。SOD-2表達(dá)對(duì)急性肺損傷有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、寒冷組相比，輻射暴露顯著增加了大鼠肺組織氧化應(yīng)激因子MDA5的表達(dá)增加，表明放射組和凍-放射組大鼠肺組織中存在高水平的氧化應(yīng)激，而利于清除氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的SOD-2的表達(dá)降低[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Sirt3水平可促進(jìn)SOD-2、Nrf2、GST-Pi和GPX-1蛋白表達(dá)，抑制MDA、GSH、iNOS的水平，從而增強(qiáng)抗氧化能力，提示通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt3信號(hào)可減輕氧化損傷，對(duì)抗糖尿病肺纖維化肺損傷[13]。因本研究觀察時(shí)間較短，肺組織尚未出現(xiàn)纖維化的病理學(xué)改變，但SOD表達(dá)下降可能會(huì)促進(jìn)后續(xù)肺纖維化進(jìn)程，相關(guān)調(diào)節(jié)通路有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡是肺損傷的另一重要機(jī)制。凋亡主要由兩條不同的信號(hào)通路啟動(dòng)，一種是外源性(死亡受體依賴)途徑，另一種是內(nèi)源性(線粒體依賴)途徑[14]。當(dāng)細(xì)胞表面死亡受體(如Fas)與其配體結(jié)合時(shí)，外源性途徑被觸發(fā)。Te內(nèi)在途徑是由線粒體外膜的完整性喪失介導(dǎo)的，這導(dǎo)致線粒體蛋白(如細(xì)胞色素c)從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。線粒體途徑由Bcl2蛋白家族控制，其可以促凋亡(如Bid、Bim、Bad、Noxa)或抗凋亡(如Bcl2、Bcl-xL、Mcl1)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺組織的凋亡相關(guān)因子Cytochrome C、Bax的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)下降；與寒冷組相比，放射組和凍-放射組大鼠肺組織的凋亡相關(guān)因子Cytochrome C、Bax的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)下降，提示放射組和凍-放射組大鼠肺部組織凋亡明顯，損傷更重，其調(diào)控可能是通過(guò)線粒體途徑進(jìn)行。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺組織的Ahsg、RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)顯著增加；與對(duì)寒冷組和放射組相比，凍-放射組大鼠肺組織的Ahsg、RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)顯著增加。Ahsg是一種主要由成人肝分泌的糖蛋白，具有促炎和抗炎作用[15]。體外研究表明，AHSG刺激單核細(xì)胞遷移和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。此外，Ahsg作為一種抗炎介質(zhì)，參與巨噬細(xì)胞失活、抗纖維化活性、氧化應(yīng)激和抑制凋亡[16]。Ahsg還可能是一種內(nèi)源性配體，在通過(guò)TLR4信號(hào)調(diào)節(jié)小鼠胰島素敏感性方面起著關(guān)鍵作用[17]。此外，高表達(dá)RAGE可激活NF-κB，上調(diào)多種炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[18-19]。

綜上所述，本研究通過(guò)建立凍-放射復(fù)合傷模型，觀察到大鼠肺部損傷情況，其損傷機(jī)制可能通過(guò)Ahsg/RAGE/NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。