左禧萌,史曉光,,劉潔麗,,楊臻瑞,,高 翔,,賴 瑞,,趙 澤,,汪唐順

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院普通外科,北京100700)

肉芽腫小葉性乳腺炎是一類好發(fā)于已孕已產婦女的非哺乳期乳腺炎，其臨床特點為突發(fā)乳房腫塊，在短時間內紅腫熱痛，進而迅速化膿、破潰，形成難以愈合的竇道，侵犯乳房小葉組織；該病常常在不同階段出現(xiàn)多個病灶發(fā)作，給患者造成極大的身心損害。該病目前病因尚不明確，治療方法以手術治療與激素沖擊治療為主，但針對劑量、術式等尚未形成統(tǒng)一規(guī)范；而且醫(yī)院的經驗性治療往往參差不齊［1］，通常以患者自身意愿作為手術指征，有時導致非必要的醫(yī)源性乳房損毀，因此針對該病的最佳治療方法仍有待探討［2］。本實驗目的是構建合適的肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠模型，為臨床藥物療效的初步觀察提供一個基礎平臺，并為該病機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 人肉芽腫小葉性乳腺炎病變組織

選取在北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院乳腺科或普通外科就診的20～45歲肉芽腫小葉性乳腺炎患者5例，住院手術治療時收集這些患者的乳腺病變腺體組織標本及病灶切緣正常腺體組織標本各5份。由于肉芽腫小葉性乳腺炎的病灶較為廣泛，切除范圍往往比病灶本身更大，因此從離體病灶樣本中挑選無肉芽腫樣變的正常乳腺組織是可行的。取材前所有患者均簽署知情同意書。標本切取后，每份組織樣本約0.5 g，并用2 mL凍存管密封，置于液氮罐內保存，然后經樣本庫－80℃冰箱保存。本研究方案經過本院醫(yī)學倫理委員會審批（批號為2017-JYB-JS-063）。

1.2 實驗動物

本實驗用SD大鼠均有孕產史，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（京）2016-0006］，質量為300～400 g，共計25只。所有實驗動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院SPF級環(huán)境屏障動物實驗室［SYXK（京）2020-0013］，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度40%～70%，全新風換氣次數(shù)10次／h，氣流速度≤0.18 m/s，壓差25 Pa，潔凈度1萬級，氨濃度15 mg/m3，噪音≤60 dB，照度150～300 lx。動物實驗方案經北京中醫(yī)藥大學動物福利委員會批準（編號為19-56）。

1.3 主要試劑及儀器

完全弗氏佐劑5881型（Freund's complete adjuvant 5881）購自美國Sigma公司；手持超聲波勻漿機購自德國Hiescher公司（型號UP100 H）；光學顯微鏡購自德國Leica公司（型號DM000LED）。

1.4 病變乳腺組織勻漿液接種物制作[3-5]

將人肉芽腫小葉性乳腺炎組織的液氮保存標本運送至實驗室后，封裝的組織標本放入37℃恒溫水浴箱中復凍。復凍后將冷凍管內組織取出稱量，人工研磨至無明顯大顆粒組織后，與生理鹽水（即0.9%NaCl溶液）按1∶3比例（每1 g組織對應3 mL生理鹽水）混合，裝入離心管中置于冰上，手持超聲波勻漿機做細胞粉碎勻漿處理，進一步粉碎細胞結構，破壞細胞膜，使包漿中的蛋白釋放到溶液中。經細胞粉碎后的勻漿取上清液，置于無菌離心管內，與完全弗氏佐劑按體積比為1∶1混勻，制成油包乳混懸液（混勻過程在冰上進行，過程約20 min；注意保持其周圍溫度為0～4℃，以保持完全弗氏佐劑的活性）。制備好的混懸液即為病變乳腺組織勻漿液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 肉芽腫小葉性乳腺炎動物模型的建立及分組

造模用大鼠隨機分為5組，每組5只，分別為空白對照組、完全弗氏佐劑組、正常乳腺組織勻漿組、病變乳腺組織勻漿低劑量組和病變乳腺組織高劑量組。SD大鼠入住實驗室動物飼養(yǎng)室適應環(huán)境3 d，用1.5%戊巴比妥溶液以0.2 mL/100 g的劑量腹腔注射大鼠。麻醉后大鼠固定于木板上，第3和第4對乳房剔除毛發(fā)，碘伏溶液消毒皮膚。使用眼科鑷提起乳頭，使用接種注射器，將每組不同的接種物沿乳頭根部斜行進針，進針深度2～4 mm，注入大鼠第3和第4對乳腺內，即可完成人工種植包埋過程，出針后簡單按壓止血。注意不可進針過深導致接種物被注射至肌層?？瞻讓φ战M接種0.2 mL生理鹽水，完全弗氏佐劑組接種0.2 mL完全弗氏佐劑，正常乳腺組織勻漿組接種正常組織勻漿0.2 mL，病變乳腺組織勻漿低劑量組及高劑量組分別接種病變乳腺組織勻漿0.1 mL和0.2 mL。

1.6 臨床觀察

各組大鼠接種后，常規(guī)維持性飼養(yǎng)。每天對各組大鼠的臨床表現(xiàn)進行觀察，并記錄各組動物的變化，包括大鼠體質量、乳房橫徑及皮膚顏色。肉芽腫小葉性乳腺炎改變的大鼠往往表現(xiàn)為乳房局部皮膚紅腫、乳房橫徑增大，甚至出現(xiàn)破潰表現(xiàn)。

1.7 HE染色及病理診斷標準

于接種后第14天將全部大鼠以斷頸法處死，切取第3對和第4對乳腺組織，注意不要帶入毛發(fā)及皮膚，清水稍沖洗后放入4%的甲醛溶液中固定。常規(guī)石蠟包埋和切片，切片厚度為4μm。取切片理想的乳腺組織，脫蠟后行HE染色，最后脫水封固。光學顯微鏡下觀察乳腺組織形態(tài)，進行病理診斷。

病理診斷標準：炎癥輕者乳腺小葉中可見導管和腺泡成分，終末導管擴張，腔內空虛或含有壞死物，導管及腺泡上皮可萎縮、消失或增生，伴淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，小葉特化間質疏松，呈水腫樣改變。炎癥重者上皮成分破壞或消失，有大量中性粒細胞為主的炎細胞浸潤，可見上皮樣細胞和多核巨噬細胞，多核巨噬細胞為朗格漢型或杜頓型，極少或無異物型，巨噬細胞內無Schaumann小體，大多數(shù)病例的小葉中央可見小膿腫和脂質空泡。病變融合者的小葉結構消失，形成大片狀和（或）結節(jié)狀慢性化膿性肉芽腫性病灶，并可形成膿腫、皮膚破潰及竇道；小葉內、小葉間導管周圍見多種炎性細胞浸潤，以嗜中性粒細胞為主，可有單核細胞、淋巴細胞；乳腺間質可有纖維組織增生和（或）硬化，亦可見有小血管炎。因此，病理組織中可見慢性化膿性肉芽腫性病灶，并伴有炎性細胞浸潤，且以巨噬細胞及中性粒細胞為主，則可診斷為肉芽腫小葉性乳腺炎［6-8］。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析處理。結果數(shù)據(jù)使用百分比及頻次表示，計數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床觀察

自接種后第1天起，大鼠體質量在各組之間無明顯差異。病變乳腺組織勻漿高劑量組與低劑量組均出現(xiàn)肉芽腫小葉性乳腺炎的臨床改變，即被接種的乳房出現(xiàn)紅腫、體積增大、破潰后不易愈合等表現(xiàn)（圖1），而且1只大鼠出現(xiàn)了非接種乳房的肉芽腫小葉性乳腺炎樣改變。空白對照組、完全弗氏佐劑組和正常乳腺組織勻漿組均無乳房紅腫表現(xiàn)，其中完全弗氏佐劑組有1只大鼠出現(xiàn)了乳腺體積增大，經病理診斷為少量炎性細胞浸潤的炎癥改變，無明顯肉芽腫組織生成。對各組大鼠的臨床表現(xiàn)進行每日觀察后，記錄發(fā)病情況見表1。

表1 各組大鼠乳腺發(fā)病情況Table1 Morbidity of mammary glandsin theratsof each group（各組n=5）

圖1 乳腺病變大鼠外觀Figure1 Appearanceof mammary gland lesionsin a rat

2.2 病理診斷

接種2周后處死大鼠，取乳腺組織進行HE染色，病理診斷結果見圖2。其中，病變乳腺組織勻漿高劑量組的乳腺小葉完全破壞，大片結節(jié)樣慢性肉芽腫炎性病灶生成；病變乳腺組織勻漿低劑量組可見乳腺小葉組織邊界不清，腺葉內出現(xiàn)空泡，且伴隨大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，高倍鏡下可見多核巨細胞。完全弗氏佐劑組與正常乳腺組織勻漿組雖然可見少量淋巴細胞浸潤，但未見乳腺小葉出現(xiàn)肉芽腫樣改變。本研究中僅接種病變乳腺組織勻漿液的組別出現(xiàn)了陽性改變，正常乳腺組織勻漿組、完全弗氏佐劑組、空白對照組均未出現(xiàn)肉芽腫樣改變。組間對比使用卡方檢驗，提示P＜0.001，差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 各組大鼠乳腺組織HE染色Figure 2 HE staining of rat mammary gland specimens in each group

3 討論

目前針對肉芽腫小葉性乳腺炎的病因理論假說主要有細菌感染與自身免疫反應兩種［9-12］。超聲波細胞粉碎機是一種利用強超聲在液體中產生空化效應，對物質進行超聲處理的多功能、多用途的儀器，能用于動植物組織、細胞、細菌、芽胞菌種的破碎，同時可用來乳化、分離、分散、勻化、提取、脫氣、清洗及加速化學反應等。由于本實驗中病變乳腺組織勻漿經超聲破碎，細胞結構已經破壞，不存在細菌及其他細胞，因此本研究中動物模型建立結果說明僅依靠病變組織內活性成分即可導致疾病發(fā)作，提示肉芽腫小葉性乳腺炎并非細菌感染性疾病，這為證明該病是由自身免疫反應異常引起提供了一定依據(jù)。但是需要說明，病變組織勻漿中也可能存在細菌死亡后釋放的內毒素等物質，因此本研究結果并不能否定肉芽腫小葉性乳腺炎與細菌的相關性。除此之外，肉芽腫小葉性乳腺炎的發(fā)病原因在本實驗中尚無明確體現(xiàn)，僅證明了人肉芽腫乳腺炎勻漿可導致大鼠乳腺組織發(fā)生同類型改變，還無法證明最初引起該病的原因。

本文所用完全弗氏佐劑是一種增強免疫原性制劑，主要作用如下：（1）形成抗原儲存庫［13］；（2）形成局部肉芽腫；（3）刺激淋巴細胞增殖和分化［14］。上述3點作用均為肉芽腫小葉性乳腺炎的發(fā)生提供了需要的條件。既往針對漿細胞乳腺炎的研究提示，經單純完全弗氏佐劑注射后的乳腺組織會產生中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，但未發(fā)現(xiàn)漿細胞或類漿細胞性乳腺炎改變。本研究中完全弗氏佐劑組也出現(xiàn)了炎性細胞浸潤的改變，但不明顯，說明完全弗氏佐劑對炎癥形成有促進作用，但其單獨使用并不能誘導建立病變模型。

除此之外，本實驗中1只大鼠出現(xiàn)了除第3、第4對乳房之外其他乳房的紅腫改變，經取材后病理觀察提示為慢性化膿性炎癥肉芽腫性乳腺炎，推測可能是誘發(fā)疾病的物質進入血液循環(huán)導致疾病在其他乳房發(fā)生。另外，1只注射了單純完全弗氏佐劑的大鼠出現(xiàn)了乳房腺體下油包乳溶液的炎性包裹，但光學顯微鏡下病理診斷提示非肉芽腫小葉性乳腺炎改變，可能是由于注射操作失誤導致完全弗氏佐劑未被大鼠乳腺吸收。

本次實驗的優(yōu)點是建立了首個肉芽腫小葉性乳腺炎動物模型，該模型與人肉芽腫小葉性乳腺炎相近且造模時間較短，而且其發(fā)病過程受注射抗原劑量影響可控。本實驗的缺點是樣本量較小，需要進一步擴大樣本量做驗證實驗；另外，本實驗建立的模型尚無法針對患者下肢紅斑、關節(jié)疼痛等癥狀進行模擬［15］，有待后續(xù)進一步改進。

綜上所述，本實驗為肉芽腫小葉性乳腺炎動物造模提供了一個新思路，通過對造模動物的干預，或許在未來可以找到除激素沖擊治療之外療效迅速、治愈率高的新的用藥方式，從而進一步對肉芽腫小葉性乳腺炎的病因學做深入研究。