左禧萌,史曉光,,劉潔麗,,楊臻瑞,,高 翔,,賴 瑞,,趙 澤,,汪唐順

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院普通外科,北京100700)

肉芽腫小葉性乳腺炎是一類好發(fā)于已孕已產(chǎn)婦女的非哺乳期乳腺炎，其臨床特點(diǎn)為突發(fā)乳房腫塊，在短時(shí)間內(nèi)紅腫熱痛，進(jìn)而迅速化膿、破潰，形成難以愈合的竇道，侵犯乳房小葉組織；該病常常在不同階段出現(xiàn)多個(gè)病灶發(fā)作，給患者造成極大的身心損害。該病目前病因尚不明確，治療方法以手術(shù)治療與激素沖擊治療為主，但針對劑量、術(shù)式等尚未形成統(tǒng)一規(guī)范；而且醫(yī)院的經(jīng)驗(yàn)性治療往往參差不齊［1］，通常以患者自身意愿作為手術(shù)指征，有時(shí)導(dǎo)致非必要的醫(yī)源性乳房損毀，因此針對該病的最佳治療方法仍有待探討［2］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菢?gòu)建合適的肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠模型，為臨床藥物療效的初步觀察提供一個(gè)基礎(chǔ)平臺，并為該病機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 人肉芽腫小葉性乳腺炎病變組織

選取在北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院乳腺科或普通外科就診的20～45歲肉芽腫小葉性乳腺炎患者5例，住院手術(shù)治療時(shí)收集這些患者的乳腺病變腺體組織標(biāo)本及病灶切緣正常腺體組織標(biāo)本各5份。由于肉芽腫小葉性乳腺炎的病灶較為廣泛，切除范圍往往比病灶本身更大，因此從離體病灶樣本中挑選無肉芽腫樣變的正常乳腺組織是可行的。取材前所有患者均簽署知情同意書。標(biāo)本切取后，每份組織樣本約0.5 g，并用2 mL凍存管密封，置于液氮罐內(nèi)保存，然后經(jīng)樣本庫－80℃冰箱保存。本研究方案經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（批號為2017-JYB-JS-063）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)用SD大鼠均有孕產(chǎn)史，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0006］，質(zhì)量為300～400 g，共計(jì)25只。所有實(shí)驗(yàn)動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院SPF級環(huán)境屏障動物實(shí)驗(yàn)室［SYXK（京）2020-0013］，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度40%～70%，全新風(fēng)換氣次數(shù)10次／h，氣流速度≤0.18 m/s，壓差25 Pa，潔凈度1萬級，氨濃度15 mg/m3，噪音≤60 dB，照度150～300 lx。動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物福利委員會批準(zhǔn)（編號為19-56）。

1.3 主要試劑及儀器

完全弗氏佐劑5881型（Freund's complete adjuvant 5881）購自美國Sigma公司；手持超聲波勻漿機(jī)購自德國Hiescher公司（型號UP100 H）；光學(xué)顯微鏡購自德國Leica公司（型號DM000LED）。

1.4 病變?nèi)橄俳M織勻漿液接種物制作[3-5]

將人肉芽腫小葉性乳腺炎組織的液氮保存標(biāo)本運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，封裝的組織標(biāo)本放入37℃恒溫水浴箱中復(fù)凍。復(fù)凍后將冷凍管內(nèi)組織取出稱量，人工研磨至無明顯大顆粒組織后，與生理鹽水（即0.9%NaCl溶液）按1∶3比例（每1 g組織對應(yīng)3 mL生理鹽水）混合，裝入離心管中置于冰上，手持超聲波勻漿機(jī)做細(xì)胞粉碎勻漿處理，進(jìn)一步粉碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞膜，使包漿中的蛋白釋放到溶液中。經(jīng)細(xì)胞粉碎后的勻漿取上清液，置于無菌離心管內(nèi)，與完全弗氏佐劑按體積比為1∶1混勻，制成油包乳混懸液（混勻過程在冰上進(jìn)行，過程約20 min；注意保持其周圍溫度為0～4℃，以保持完全弗氏佐劑的活性）。制備好的混懸液即為病變?nèi)橄俳M織勻漿液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 肉芽腫小葉性乳腺炎動物模型的建立及分組

造模用大鼠隨機(jī)分為5組，每組5只，分別為空白對照組、完全弗氏佐劑組、正常乳腺組織勻漿組、病變?nèi)橄俳M織勻漿低劑量組和病變?nèi)橄俳M織高劑量組。SD大鼠入住實(shí)驗(yàn)室動物飼養(yǎng)室適應(yīng)環(huán)境3 d，用1.5%戊巴比妥溶液以0.2 mL/100 g的劑量腹腔注射大鼠。麻醉后大鼠固定于木板上，第3和第4對乳房剔除毛發(fā)，碘伏溶液消毒皮膚。使用眼科鑷提起乳頭，使用接種注射器，將每組不同的接種物沿乳頭根部斜行進(jìn)針，進(jìn)針深度2～4 mm，注入大鼠第3和第4對乳腺內(nèi)，即可完成人工種植包埋過程，出針后簡單按壓止血。注意不可進(jìn)針過深導(dǎo)致接種物被注射至肌層?？瞻讓φ战M接種0.2 mL生理鹽水，完全弗氏佐劑組接種0.2 mL完全弗氏佐劑，正常乳腺組織勻漿組接種正常組織勻漿0.2 mL，病變?nèi)橄俳M織勻漿低劑量組及高劑量組分別接種病變?nèi)橄俳M織勻漿0.1 mL和0.2 mL。

1.6 臨床觀察

各組大鼠接種后，常規(guī)維持性飼養(yǎng)。每天對各組大鼠的臨床表現(xiàn)進(jìn)行觀察，并記錄各組動物的變化，包括大鼠體質(zhì)量、乳房橫徑及皮膚顏色。肉芽腫小葉性乳腺炎改變的大鼠往往表現(xiàn)為乳房局部皮膚紅腫、乳房橫徑增大，甚至出現(xiàn)破潰表現(xiàn)。

1.7 HE染色及病理診斷標(biāo)準(zhǔn)

于接種后第14天將全部大鼠以斷頸法處死，切取第3對和第4對乳腺組織，注意不要帶入毛發(fā)及皮膚，清水稍沖洗后放入4%的甲醛溶液中固定。常規(guī)石蠟包埋和切片，切片厚度為4μm。取切片理想的乳腺組織，脫蠟后行HE染色，最后脫水封固。光學(xué)顯微鏡下觀察乳腺組織形態(tài)，進(jìn)行病理診斷。

病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：炎癥輕者乳腺小葉中可見導(dǎo)管和腺泡成分，終末導(dǎo)管擴(kuò)張，腔內(nèi)空虛或含有壞死物，導(dǎo)管及腺泡上皮可萎縮、消失或增生，伴淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，小葉特化間質(zhì)疏松，呈水腫樣改變。炎癥重者上皮成分破壞或消失，有大量中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，可見上皮樣細(xì)胞和多核巨噬細(xì)胞，多核巨噬細(xì)胞為朗格漢型或杜頓型，極少或無異物型，巨噬細(xì)胞內(nèi)無Schaumann小體，大多數(shù)病例的小葉中央可見小膿腫和脂質(zhì)空泡。病變?nèi)诤险叩男∪~結(jié)構(gòu)消失，形成大片狀和（或）結(jié)節(jié)狀慢性化膿性肉芽腫性病灶，并可形成膿腫、皮膚破潰及竇道；小葉內(nèi)、小葉間導(dǎo)管周圍見多種炎性細(xì)胞浸潤，以嗜中性粒細(xì)胞為主，可有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞；乳腺間質(zhì)可有纖維組織增生和（或）硬化，亦可見有小血管炎。因此，病理組織中可見慢性化膿性肉芽腫性病灶，并伴有炎性細(xì)胞浸潤，且以巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主，則可診斷為肉芽腫小葉性乳腺炎［6-8］。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。結(jié)果數(shù)據(jù)使用百分比及頻次表示，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

自接種后第1天起，大鼠體質(zhì)量在各組之間無明顯差異。病變?nèi)橄俳M織勻漿高劑量組與低劑量組均出現(xiàn)肉芽腫小葉性乳腺炎的臨床改變，即被接種的乳房出現(xiàn)紅腫、體積增大、破潰后不易愈合等表現(xiàn)（圖1），而且1只大鼠出現(xiàn)了非接種乳房的肉芽腫小葉性乳腺炎樣改變。空白對照組、完全弗氏佐劑組和正常乳腺組織勻漿組均無乳房紅腫表現(xiàn)，其中完全弗氏佐劑組有1只大鼠出現(xiàn)了乳腺體積增大，經(jīng)病理診斷為少量炎性細(xì)胞浸潤的炎癥改變，無明顯肉芽腫組織生成。對各組大鼠的臨床表現(xiàn)進(jìn)行每日觀察后，記錄發(fā)病情況見表1。

表1 各組大鼠乳腺發(fā)病情況Table1 Morbidity of mammary glandsin theratsof each group（各組n=5）

圖1 乳腺病變大鼠外觀Figure1 Appearanceof mammary gland lesionsin a rat

2.2 病理診斷

接種2周后處死大鼠，取乳腺組織進(jìn)行HE染色，病理診斷結(jié)果見圖2。其中，病變?nèi)橄俳M織勻漿高劑量組的乳腺小葉完全破壞，大片結(jié)節(jié)樣慢性肉芽腫炎性病灶生成；病變?nèi)橄俳M織勻漿低劑量組可見乳腺小葉組織邊界不清，腺葉內(nèi)出現(xiàn)空泡，且伴隨大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，高倍鏡下可見多核巨細(xì)胞。完全弗氏佐劑組與正常乳腺組織勻漿組雖然可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，但未見乳腺小葉出現(xiàn)肉芽腫樣改變。本研究中僅接種病變?nèi)橄俳M織勻漿液的組別出現(xiàn)了陽性改變，正常乳腺組織勻漿組、完全弗氏佐劑組、空白對照組均未出現(xiàn)肉芽腫樣改變。組間對比使用卡方檢驗(yàn)，提示P＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組大鼠乳腺組織HE染色Figure 2 HE staining of rat mammary gland specimens in each group

3 討論

目前針對肉芽腫小葉性乳腺炎的病因理論假說主要有細(xì)菌感染與自身免疫反應(yīng)兩種［9-12］。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)是一種利用強(qiáng)超聲在液體中產(chǎn)生空化效應(yīng)，對物質(zhì)進(jìn)行超聲處理的多功能、多用途的儀器，能用于動植物組織、細(xì)胞、細(xì)菌、芽胞菌種的破碎，同時(shí)可用來乳化、分離、分散、勻化、提取、脫氣、清洗及加速化學(xué)反應(yīng)等。由于本實(shí)驗(yàn)中病變?nèi)橄俳M織勻漿經(jīng)超聲破碎，細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞，不存在細(xì)菌及其他細(xì)胞，因此本研究中動物模型建立結(jié)果說明僅依靠病變組織內(nèi)活性成分即可導(dǎo)致疾病發(fā)作，提示肉芽腫小葉性乳腺炎并非細(xì)菌感染性疾病，這為證明該病是由自身免疫反應(yīng)異常引起提供了一定依據(jù)。但是需要說明，病變組織勻漿中也可能存在細(xì)菌死亡后釋放的內(nèi)毒素等物質(zhì)，因此本研究結(jié)果并不能否定肉芽腫小葉性乳腺炎與細(xì)菌的相關(guān)性。除此之外，肉芽腫小葉性乳腺炎的發(fā)病原因在本實(shí)驗(yàn)中尚無明確體現(xiàn)，僅證明了人肉芽腫乳腺炎勻漿可導(dǎo)致大鼠乳腺組織發(fā)生同類型改變，還無法證明最初引起該病的原因。

本文所用完全弗氏佐劑是一種增強(qiáng)免疫原性制劑，主要作用如下：（1）形成抗原儲存庫［13］；（2）形成局部肉芽腫；（3）刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化［14］。上述3點(diǎn)作用均為肉芽腫小葉性乳腺炎的發(fā)生提供了需要的條件。既往針對漿細(xì)胞乳腺炎的研究提示，經(jīng)單純完全弗氏佐劑注射后的乳腺組織會產(chǎn)生中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，但未發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞或類漿細(xì)胞性乳腺炎改變。本研究中完全弗氏佐劑組也出現(xiàn)了炎性細(xì)胞浸潤的改變，但不明顯，說明完全弗氏佐劑對炎癥形成有促進(jìn)作用，但其單獨(dú)使用并不能誘導(dǎo)建立病變模型。

除此之外，本實(shí)驗(yàn)中1只大鼠出現(xiàn)了除第3、第4對乳房之外其他乳房的紅腫改變，經(jīng)取材后病理觀察提示為慢性化膿性炎癥肉芽腫性乳腺炎，推測可能是誘發(fā)疾病的物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)導(dǎo)致疾病在其他乳房發(fā)生。另外，1只注射了單純完全弗氏佐劑的大鼠出現(xiàn)了乳房腺體下油包乳溶液的炎性包裹，但光學(xué)顯微鏡下病理診斷提示非肉芽腫小葉性乳腺炎改變，可能是由于注射操作失誤導(dǎo)致完全弗氏佐劑未被大鼠乳腺吸收。

本次實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是建立了首個(gè)肉芽腫小葉性乳腺炎動物模型，該模型與人肉芽腫小葉性乳腺炎相近且造模時(shí)間較短，而且其發(fā)病過程受注射抗原劑量影響可控。本實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是樣本量較小，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；另外，本實(shí)驗(yàn)建立的模型尚無法針對患者下肢紅斑、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀進(jìn)行模擬［15］，有待后續(xù)進(jìn)一步改進(jìn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為肉芽腫小葉性乳腺炎動物造模提供了一個(gè)新思路，通過對造模動物的干預(yù)，或許在未來可以找到除激素沖擊治療之外療效迅速、治愈率高的新的用藥方式，從而進(jìn)一步對肉芽腫小葉性乳腺炎的病因?qū)W做深入研究。