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        肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠模型建立初探

        2021-09-18 07:02:34左禧萌史曉光劉潔麗楊臻瑞汪唐順
        關(guān)鍵詞:弗氏佐劑勻漿

        左禧萌,史曉光,,劉潔麗,,楊臻瑞,,高 翔,,賴(lài) 瑞,,趙 澤,,汪唐順

        (北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院普通外科,北京100700)

        肉芽腫小葉性乳腺炎是一類(lèi)好發(fā)于已孕已產(chǎn)婦女的非哺乳期乳腺炎,其臨床特點(diǎn)為突發(fā)乳房腫塊,在短時(shí)間內(nèi)紅腫熱痛,進(jìn)而迅速化膿、破潰,形成難以愈合的竇道,侵犯乳房小葉組織;該病常常在不同階段出現(xiàn)多個(gè)病灶發(fā)作,給患者造成極大的身心損害。該病目前病因尚不明確,治療方法以手術(shù)治療與激素沖擊治療為主,但針對(duì)劑量、術(shù)式等尚未形成統(tǒng)一規(guī)范;而且醫(yī)院的經(jīng)驗(yàn)性治療往往參差不齊[1],通常以患者自身意愿作為手術(shù)指征,有時(shí)導(dǎo)致非必要的醫(yī)源性乳房損毀,因此針對(duì)該病的最佳治療方法仍有待探討[2]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菢?gòu)建合適的肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠模型,為臨床藥物療效的初步觀(guān)察提供一個(gè)基礎(chǔ)平臺(tái),并為該病機(jī)制研究提供新的思路。

        1 材料與方法

        1.1 人肉芽腫小葉性乳腺炎病變組織

        選取在北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院乳腺科或普通外科就診的20~45歲肉芽腫小葉性乳腺炎患者5例,住院手術(shù)治療時(shí)收集這些患者的乳腺病變腺體組織標(biāo)本及病灶切緣正常腺體組織標(biāo)本各5份。由于肉芽腫小葉性乳腺炎的病灶較為廣泛,切除范圍往往比病灶本身更大,因此從離體病灶樣本中挑選無(wú)肉芽腫樣變的正常乳腺組織是可行的。取材前所有患者均簽署知情同意書(shū)。標(biāo)本切取后,每份組織樣本約0.5 g,并用2 mL凍存管密封,置于液氮罐內(nèi)保存,然后經(jīng)樣本庫(kù)-80℃冰箱保存。本研究方案經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批號(hào)為2017-JYB-JS-063)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        本實(shí)驗(yàn)用SD大鼠均有孕產(chǎn)史,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006],質(zhì)量為300~400 g,共計(jì)25只。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院SPF級(jí)環(huán)境屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(京)2020-0013],飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18~29℃,日溫差≤3℃,相對(duì)濕度40%~70%,全新風(fēng)換氣次數(shù)10次/h,氣流速度≤0.18 m/s,壓差25 Pa,潔凈度1萬(wàn)級(jí),氨濃度15 mg/m3,噪音≤60 dB,照度150~300 lx。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)為19-56)。

        1.3 主要試劑及儀器

        完全弗氏佐劑5881型(Freund's complete adjuvant 5881)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;手持超聲波勻漿機(jī)購(gòu)自德國(guó)Hiescher公司(型號(hào)UP100 H);光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司(型號(hào)DM000LED)。

        1.4 病變?nèi)橄俳M織勻漿液接種物制作[3-5]

        將人肉芽腫小葉性乳腺炎組織的液氮保存標(biāo)本運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后,封裝的組織標(biāo)本放入37℃恒溫水浴箱中復(fù)凍。復(fù)凍后將冷凍管內(nèi)組織取出稱(chēng)量,人工研磨至無(wú)明顯大顆粒組織后,與生理鹽水(即0.9%NaCl溶液)按1∶3比例(每1 g組織對(duì)應(yīng)3 mL生理鹽水)混合,裝入離心管中置于冰上,手持超聲波勻漿機(jī)做細(xì)胞粉碎勻漿處理,進(jìn)一步粉碎細(xì)胞結(jié)構(gòu),破壞細(xì)胞膜,使包漿中的蛋白釋放到溶液中。經(jīng)細(xì)胞粉碎后的勻漿取上清液,置于無(wú)菌離心管內(nèi),與完全弗氏佐劑按體積比為1∶1混勻,制成油包乳混懸液(混勻過(guò)程在冰上進(jìn)行,過(guò)程約20 min;注意保持其周?chē)鷾囟葹?~4℃,以保持完全弗氏佐劑的活性)。制備好的混懸液即為病變?nèi)橄俳M織勻漿液,置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 肉芽腫小葉性乳腺炎動(dòng)物模型的建立及分組

        造模用大鼠隨機(jī)分為5組,每組5只,分別為空白對(duì)照組、完全弗氏佐劑組、正常乳腺組織勻漿組、病變?nèi)橄俳M織勻漿低劑量組和病變?nèi)橄俳M織高劑量組。SD大鼠入住實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)室適應(yīng)環(huán)境3 d,用1.5%戊巴比妥溶液以0.2 mL/100 g的劑量腹腔注射大鼠。麻醉后大鼠固定于木板上,第3和第4對(duì)乳房剔除毛發(fā),碘伏溶液消毒皮膚。使用眼科鑷提起乳頭,使用接種注射器,將每組不同的接種物沿乳頭根部斜行進(jìn)針,進(jìn)針深度2~4 mm,注入大鼠第3和第4對(duì)乳腺內(nèi),即可完成人工種植包埋過(guò)程,出針后簡(jiǎn)單按壓止血。注意不可進(jìn)針過(guò)深導(dǎo)致接種物被注射至肌層??瞻讓?duì)照組接種0.2 mL生理鹽水,完全弗氏佐劑組接種0.2 mL完全弗氏佐劑,正常乳腺組織勻漿組接種正常組織勻漿0.2 mL,病變?nèi)橄俳M織勻漿低劑量組及高劑量組分別接種病變?nèi)橄俳M織勻漿0.1 mL和0.2 mL。

        1.6 臨床觀(guān)察

        各組大鼠接種后,常規(guī)維持性飼養(yǎng)。每天對(duì)各組大鼠的臨床表現(xiàn)進(jìn)行觀(guān)察,并記錄各組動(dòng)物的變化,包括大鼠體質(zhì)量、乳房橫徑及皮膚顏色。肉芽腫小葉性乳腺炎改變的大鼠往往表現(xiàn)為乳房局部皮膚紅腫、乳房橫徑增大,甚至出現(xiàn)破潰表現(xiàn)。

        1.7 HE染色及病理診斷標(biāo)準(zhǔn)

        于接種后第14天將全部大鼠以斷頸法處死,切取第3對(duì)和第4對(duì)乳腺組織,注意不要帶入毛發(fā)及皮膚,清水稍沖洗后放入4%的甲醛溶液中固定。常規(guī)石蠟包埋和切片,切片厚度為4μm。取切片理想的乳腺組織,脫蠟后行HE染色,最后脫水封固。光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察乳腺組織形態(tài),進(jìn)行病理診斷。

        病理診斷標(biāo)準(zhǔn):炎癥輕者乳腺小葉中可見(jiàn)導(dǎo)管和腺泡成分,終末導(dǎo)管擴(kuò)張,腔內(nèi)空虛或含有壞死物,導(dǎo)管及腺泡上皮可萎縮、消失或增生,伴淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),小葉特化間質(zhì)疏松,呈水腫樣改變。炎癥重者上皮成分破壞或消失,有大量中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)上皮樣細(xì)胞和多核巨噬細(xì)胞,多核巨噬細(xì)胞為朗格漢型或杜頓型,極少或無(wú)異物型,巨噬細(xì)胞內(nèi)無(wú)Schaumann小體,大多數(shù)病例的小葉中央可見(jiàn)小膿腫和脂質(zhì)空泡。病變?nèi)诤险叩男∪~結(jié)構(gòu)消失,形成大片狀和(或)結(jié)節(jié)狀慢性化膿性肉芽腫性病灶,并可形成膿腫、皮膚破潰及竇道;小葉內(nèi)、小葉間導(dǎo)管周?chē)?jiàn)多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以嗜中性粒細(xì)胞為主,可有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞;乳腺間質(zhì)可有纖維組織增生和(或)硬化,亦可見(jiàn)有小血管炎。因此,病理組織中可見(jiàn)慢性化膿性肉芽腫性病灶,并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且以巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主,則可診斷為肉芽腫小葉性乳腺炎[6-8]。

        1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

        采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。結(jié)果數(shù)據(jù)使用百分比及頻次表示,計(jì)數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 臨床觀(guān)察

        自接種后第1天起,大鼠體質(zhì)量在各組之間無(wú)明顯差異。病變?nèi)橄俳M織勻漿高劑量組與低劑量組均出現(xiàn)肉芽腫小葉性乳腺炎的臨床改變,即被接種的乳房出現(xiàn)紅腫、體積增大、破潰后不易愈合等表現(xiàn)(圖1),而且1只大鼠出現(xiàn)了非接種乳房的肉芽腫小葉性乳腺炎樣改變??瞻讓?duì)照組、完全弗氏佐劑組和正常乳腺組織勻漿組均無(wú)乳房紅腫表現(xiàn),其中完全弗氏佐劑組有1只大鼠出現(xiàn)了乳腺體積增大,經(jīng)病理診斷為少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥改變,無(wú)明顯肉芽腫組織生成。對(duì)各組大鼠的臨床表現(xiàn)進(jìn)行每日觀(guān)察后,記錄發(fā)病情況見(jiàn)表1。

        表1 各組大鼠乳腺發(fā)病情況Table1 Morbidity of mammary glandsin theratsof each group(各組n=5)

        圖1 乳腺病變大鼠外觀(guān)Figure1 Appearanceof mammary gland lesionsin a rat

        2.2 病理診斷

        接種2周后處死大鼠,取乳腺組織進(jìn)行HE染色,病理診斷結(jié)果見(jiàn)圖2。其中,病變?nèi)橄俳M織勻漿高劑量組的乳腺小葉完全破壞,大片結(jié)節(jié)樣慢性肉芽腫炎性病灶生成;病變?nèi)橄俳M織勻漿低劑量組可見(jiàn)乳腺小葉組織邊界不清,腺葉內(nèi)出現(xiàn)空泡,且伴隨大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),高倍鏡下可見(jiàn)多核巨細(xì)胞。完全弗氏佐劑組與正常乳腺組織勻漿組雖然可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),但未見(jiàn)乳腺小葉出現(xiàn)肉芽腫樣改變。本研究中僅接種病變?nèi)橄俳M織勻漿液的組別出現(xiàn)了陽(yáng)性改變,正常乳腺組織勻漿組、完全弗氏佐劑組、空白對(duì)照組均未出現(xiàn)肉芽腫樣改變。組間對(duì)比使用卡方檢驗(yàn),提示P<0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        圖2 各組大鼠乳腺組織HE染色Figure 2 HE staining of rat mammary gland specimens in each group

        3 討論

        目前針對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎的病因理論假說(shuō)主要有細(xì)菌感染與自身免疫反應(yīng)兩種[9-12]。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)是一種利用強(qiáng)超聲在液體中產(chǎn)生空化效應(yīng),對(duì)物質(zhì)進(jìn)行超聲處理的多功能、多用途的儀器,能用于動(dòng)植物組織、細(xì)胞、細(xì)菌、芽胞菌種的破碎,同時(shí)可用來(lái)乳化、分離、分散、勻化、提取、脫氣、清洗及加速化學(xué)反應(yīng)等。由于本實(shí)驗(yàn)中病變?nèi)橄俳M織勻漿經(jīng)超聲破碎,細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞,不存在細(xì)菌及其他細(xì)胞,因此本研究中動(dòng)物模型建立結(jié)果說(shuō)明僅依靠病變組織內(nèi)活性成分即可導(dǎo)致疾病發(fā)作,提示肉芽腫小葉性乳腺炎并非細(xì)菌感染性疾病,這為證明該病是由自身免疫反應(yīng)異常引起提供了一定依據(jù)。但是需要說(shuō)明,病變組織勻漿中也可能存在細(xì)菌死亡后釋放的內(nèi)毒素等物質(zhì),因此本研究結(jié)果并不能否定肉芽腫小葉性乳腺炎與細(xì)菌的相關(guān)性。除此之外,肉芽腫小葉性乳腺炎的發(fā)病原因在本實(shí)驗(yàn)中尚無(wú)明確體現(xiàn),僅證明了人肉芽腫乳腺炎勻漿可導(dǎo)致大鼠乳腺組織發(fā)生同類(lèi)型改變,還無(wú)法證明最初引起該病的原因。

        本文所用完全弗氏佐劑是一種增強(qiáng)免疫原性制劑,主要作用如下:(1)形成抗原儲(chǔ)存庫(kù)[13];(2)形成局部肉芽腫;(3)刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化[14]。上述3點(diǎn)作用均為肉芽腫小葉性乳腺炎的發(fā)生提供了需要的條件。既往針對(duì)漿細(xì)胞乳腺炎的研究提示,經(jīng)單純完全弗氏佐劑注射后的乳腺組織會(huì)產(chǎn)生中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),但未發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞或類(lèi)漿細(xì)胞性乳腺炎改變。本研究中完全弗氏佐劑組也出現(xiàn)了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的改變,但不明顯,說(shuō)明完全弗氏佐劑對(duì)炎癥形成有促進(jìn)作用,但其單獨(dú)使用并不能誘導(dǎo)建立病變模型。

        除此之外,本實(shí)驗(yàn)中1只大鼠出現(xiàn)了除第3、第4對(duì)乳房之外其他乳房的紅腫改變,經(jīng)取材后病理觀(guān)察提示為慢性化膿性炎癥肉芽腫性乳腺炎,推測(cè)可能是誘發(fā)疾病的物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)導(dǎo)致疾病在其他乳房發(fā)生。另外,1只注射了單純完全弗氏佐劑的大鼠出現(xiàn)了乳房腺體下油包乳溶液的炎性包裹,但光學(xué)顯微鏡下病理診斷提示非肉芽腫小葉性乳腺炎改變,可能是由于注射操作失誤導(dǎo)致完全弗氏佐劑未被大鼠乳腺吸收。

        本次實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是建立了首個(gè)肉芽腫小葉性乳腺炎動(dòng)物模型,該模型與人肉芽腫小葉性乳腺炎相近且造模時(shí)間較短,而且其發(fā)病過(guò)程受注射抗原劑量影響可控。本實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是樣本量較小,需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn);另外,本實(shí)驗(yàn)建立的模型尚無(wú)法針對(duì)患者下肢紅斑、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀進(jìn)行模擬[15],有待后續(xù)進(jìn)一步改進(jìn)。

        綜上所述,本實(shí)驗(yàn)為肉芽腫小葉性乳腺炎動(dòng)物造模提供了一個(gè)新思路,通過(guò)對(duì)造模動(dòng)物的干預(yù),或許在未來(lái)可以找到除激素沖擊治療之外療效迅速、治愈率高的新的用藥方式,從而進(jìn)一步對(duì)肉芽腫小葉性乳腺炎的病因?qū)W做深入研究。

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