劉磊 張景曉 狄曉萌 謝竹霄 王佳偉

中樞神經系統(tǒng)感染是最嚴重的感染性疾病之一，具有病程進展迅速、病死率高等特點，主要包括感染性腦炎、腦膜炎、腦膜腦炎和脊髓炎，表現(xiàn)為精神行為異常、癲發(fā)作、頭痛、發(fā)熱、局灶性神經功能缺損，常見病原微生物為細菌、病毒、真菌、寄生蟲等，若不及時對病原體進行針對性治療，病情迅速加重，可出現(xiàn)癲持續(xù)狀態(tài)、昏迷，甚至危及生命［1］。臨床鑒別診斷中樞神經系統(tǒng)感染與自身免疫性腦炎、中樞神經系統(tǒng)血管炎、原發(fā)性或轉移性腦腫瘤、代謝中毒性疾病困難，故病原學診斷至關重要。組織活檢病理仍是確診的“金標準”，但侵入性外科手術導致的并發(fā)癥使得組織活檢術的臨床實際比例極低，故在缺乏病理學檢查情況下，其診斷依賴腦脊液病原微生物的分離與培養(yǎng)［2］，但陽性率較低、耗時較長且存在一定比例的漏診和誤診，無法為臨床及時提供診斷與治療信息［3］，迫切需要一種快速、敏感、可靠的病原學診斷方法。近年來，以不針對特定病原微生物和高通量為特點的病原宏基因組第二代測序技術（mNGS）因檢測速度快、覆蓋病原微生物范圍廣、可為臨床不典型病例提供診斷依據(jù)等優(yōu)點，廣泛應用于感染性疾病的診斷［4］。一方面，腦脊液病原mNGS測序在中樞神經系統(tǒng)感染性疾病中的診斷價值已獲得越來越多的驗證［5-8］；另一方面，臨床有過分依賴mNGS測序和盲目送檢腦脊液標本的趨勢，造成不必要的浪費。鑒于此，我院對35例需排除中樞神經系統(tǒng)感染患者的腦脊液病原mNGS測序、傳統(tǒng)病原學檢測與臨床最終診斷進行對比分析，再根據(jù)7條基于臨床和常規(guī)輔助檢查結果制定的腦脊液病原mNGS測序送檢標準進行評分，探討提高mNGS測序陽性符合率的腦脊液送檢標準。

資料與方法

一、臨床資料

1.納入標準（1）本研究送檢腦脊液病原mNGS測序參照2013年國際腦炎聯(lián)盟（IEC）共識［9］，符合以下1項及以上標準：①精神狀態(tài)改變（定義為意識水平下降或改變、嗜睡或人格改變）持續(xù)時間≥24 h。②癲發(fā)作，除外既往癲或者單純熱性驚厥。③發(fā)病前或發(fā)病后72 h內記錄到體溫≥38℃。④出現(xiàn)新的局灶性神經系統(tǒng)癥狀。⑤腦脊液白細胞計數(shù)≥5/mm3。⑥影像學顯示的腦實質新發(fā)病灶提示腦炎。⑦腦電圖異常提示腦炎。（2）即使不符合上述7項送檢標準中任意一項，根據(jù)臨床需要仍需送檢腦脊液病原mNGS測序的患者。

2.排除標準（1）自身免疫性腦炎和神經系統(tǒng)副腫瘤綜合征。（2）風濕免疫性疾?。òㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、Behcet綜合征、血管炎等）繼發(fā)累及中樞神經系統(tǒng)。（3）神經梅毒和獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）。（4）臨床資料不完整。

3.一般資料選擇2017年3月至2020年4月由首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院神經內科送檢的腦脊液標本共35份，其中，男性24例，女性11例；年齡19～79歲，中位年齡52歲。

二、研究方法

1.腦脊液病原mNGS測序（1）檢測方法：所有患者均于入院48 h內完成首次腰椎穿刺抽取腦脊液2 ml，送檢深圳華大基因研究院、予果生物科技（北京）有限公司和北京金匙基因科技有限公司之一，行腦脊液病原mNGS測序。為減少不同公司檢測技術對結果的影響，通過數(shù)據(jù)量進行序列數(shù)的均一化處理：mNGS測序數(shù)據(jù)量為（15～20）×106條序列/樣本，根據(jù)每例樣本的實際總數(shù)據(jù)量將每個病原微生物的序列數(shù)進行均一化處理，計算公式為x條唯一比對序列數(shù)/百萬條序列數(shù)，再與臨床數(shù)據(jù)和信息對比分析。（2）檢出病原微生物的致病性判斷：①結合已發(fā)表文獻與本組患者臨床表現(xiàn)的一致性判斷。②結合傳統(tǒng)腦脊液病原學檢測結果相互驗證。③結合臨床用藥后癥狀改變和預后關聯(lián)分析。

2.傳統(tǒng)病原學檢測所有患者均于入院48 h內完成首次腰椎穿刺抽取腦脊液8～10 ml，行傳統(tǒng)病原學檢測，包括病原微生物培養(yǎng)、聚合酶鏈反應（PCR）、病原體抗體測定等。必要時完善血漿真菌1-3-β-D葡聚糖動態(tài)定量檢測（G試驗）/半乳甘露聚糖檢測（GM試驗）和血清病原體抗體測定。

3.中樞神經系統(tǒng)感染臨床擬診標準參照2013年國際腦炎聯(lián)盟共識［9］，臨床擬診腦炎應滿足以下條件：（1）主要標準，精神狀態(tài)改變（定義為意識水平下降或改變、嗜睡或人格改變）持續(xù)時間≥24 h，除外其他原因；癲發(fā)作，除外既往癲或單純熱性驚厥。（2）次要標準，符合以下2項標準診斷為腦炎可能，符合≥3項標準診斷為腦炎可能性大。①發(fā)病前或者發(fā)病后72 h內記錄到體溫≥38℃。②出現(xiàn)新的局灶性神經系統(tǒng)癥狀。③腦脊液白細胞計數(shù)≥5/mm3。④影像學顯示的腦實質新發(fā)病灶提示腦炎。⑤腦電圖異常提示腦炎。參照歐洲各國［歐洲神經科學協(xié)會聯(lián)盟（EFNS）、荷蘭和英國］腦膜炎診斷標準［10-12］，臨床擬診為腦膜炎應符合以下≥2項標準，（1）頭痛。（2）發(fā)熱（發(fā)病前或發(fā)病后72 h內記錄到體溫≥38℃）。（3）頸項強直。（4）意識水平下降［Glasgow昏迷量表（GCS）評分＜14］，且腰椎穿刺腦脊液白細胞計數(shù)≥5/mm3。

4.臨床最終診斷為出院診斷或死亡診斷，結合臨床擬診、腦脊液病原mNGS測序、傳統(tǒng)病原學檢測和輔助檢查（包括腰椎穿刺腦脊液常規(guī)檢測、頭部影像學檢查和腦電圖檢查等）結果綜合判斷。

5.統(tǒng)計分析方法本研究所有數(shù)據(jù)均采用R version3.5.3軟件進行處理與分析。計數(shù)資料以相對數(shù)構成比（%）或率（%）表示，采用Fisher確切概率法。以臨床最終診斷為參照，分別計算腦脊液病原mNGS測序和傳統(tǒng)病原學檢測的靈敏度和特異度、假陽性率和假陰性率、準確度、Youden指數(shù)；繪制受試者工作特征（ROC）曲線并計算曲線下面積（AUC），采用Delong檢驗比較腦脊液病原mNGS測序與傳統(tǒng)腦脊液病原學檢測的診斷效能。根據(jù)送檢腦脊液病原mNGS測序的客觀標準進行評分（滿足1條計1分），計算不同評分下mNGS測序的陽性符合率。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

本組35例患者中19例臨床最終診斷為中樞神經系統(tǒng)感染，詳見表1。其中精神狀態(tài)改變＞24 h者13例（13/19），主要表現(xiàn)為嗜睡、意識障礙、性格改變等；伴癲發(fā)作4例（4/19）；發(fā)病前或發(fā)病后72 h內記錄到體溫≥38℃者12例（12/19）；出現(xiàn)新的局灶性神經系統(tǒng)癥狀16例（16/19）；MRI顯示顱內病灶為14例（14/19），僅累及腦干1例、額葉2例、枕葉2例、顳葉1例，以及多發(fā)病灶（同時累及多個腦葉、丘腦、基底節(jié)區(qū)、小腦、腦膜等）8例；腦脊液白細胞計數(shù)≥5/mm3者14例（14/19）；14例完善腦電圖檢查，異常10例（10/14）。16例患者不符合中樞神經系統(tǒng)感染的診斷，分別為海綿竇非特異性炎癥4例、視神經脊髓炎譜系疾病3例、特發(fā)性視神經炎3例、多發(fā)性硬化1例、其他5例。

表1 19例臨床最終診斷為中樞神經系統(tǒng)感染患者的臨床資料Table 1.Clinical information of 19 patients clinically final diagnosed as central nervous system infection

本組有18例腦脊液病原mNGS測序呈陽性，總陽性率為51.43%（18/35）。臨床最終診斷為中樞神經系統(tǒng)感染的患者中17例mNGS測序呈陽性，其診斷靈敏度為17/19、特異度為15/16，Youden指數(shù)為0.832，準確度為91.43%（表2）。其中，有8例病原體為細菌，分別為單核細胞增生李斯特菌3例、鏈球菌2例、鼻疽諾卡菌1例、肺炎克雷伯菌1例、新型隱球菌1例；有7例患者病原體為病毒，其分別為人類皰疹病毒1型（HSV-1）3例，HSV-3、HSV-4和HSV-5各1例，偽狂犬病毒1型1例；1例病原體為真菌（煙曲霉菌）；余1例病原體為寄生蟲（囊蟲）。非中樞神經系統(tǒng)感染患者中1例mNGS測序呈陽性，其診斷假陽性率為1/16、假陰性率為2/19（表2），mNGS測序檢出代爾夫特食酸菌、HSV-1和HSV-4、人類腺病毒B1型、近平滑假絲酵母菌、漢氏德巴利氏酵母、擴展青霉菌、煙曲霉菌、人隱孢子蟲，但傳統(tǒng)腦脊液病原檢測均呈陰性，臨床表現(xiàn)為雙眼視力下降和眼動受限，輔助檢查結果亦未提示感染，最終診斷為多組腦神經麻痹，予以甲潑尼龍治療后腦神經麻痹癥狀好轉并痊愈，進一步證實mNGS測序結果為假陽性結果。

本組有17例傳統(tǒng)病原學檢測（包括腦脊液病原微生物培養(yǎng)和PCR反應、血漿G試驗/GM試驗、腦脊液和血清病原體抗體測定）呈陽性，總陽性率約48.57%（17/35）。臨床最終診斷為中樞神經系統(tǒng)感染的患者中14例傳統(tǒng)病原學檢測呈陽性，其診斷靈敏度為14/19、特異度為13/16，Youden指數(shù)為0.612，準確度為77.14%（表2）。其中，7例病原體為細菌，分別為鏈球菌2例、鼻疽諾卡菌1例、布魯桿菌1例、肺炎克雷伯菌1例、新型隱球菌1例、單核細胞增生李斯特菌1例；有5例病原體為病毒，分別為HSV-1 2例，HSV-2、HSV-4和HSV-5各1例；1例病原體 為真菌（煙曲霉菌）；1例病原體為寄生蟲（囊蟲）。非中樞神經系統(tǒng)感染患者中3例傳統(tǒng)病原學檢測呈陽性，其診斷假陽性率為3/16、假陰性率為5/19（表2）。

表2 腦脊液病原mNGS測序、傳統(tǒng)病原學檢測與臨床最終診斷的比較（例）Table 2. Comparison of CSF pathogen mNGS,conventional pathogen test and clinical final diagnosis(case)

進一步繪制ROC曲線，腦脊液病原mNGS測序的曲線下面 積 為0.916（95%CI：0.822～1.000，P=0.000）；傳統(tǒng)病原學檢測的曲線下面積為0.806（95%CI：0.674～0.938，P=0.000）（圖1）；二者診斷效能差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.245，P=0.213）。

圖1 ROC曲線顯示，腦脊液病原mNGS測序的曲線下面積為0.916（95%CI：0.822～1.000，P=0.000），Youden指數(shù)為0.832；傳統(tǒng)病原學檢測的曲線下面積為0.806（95%CI：0.674～0.938，P=0.000），Youden指數(shù)為0.612Figure 1 ROC curve showed the AUC of CSF pathogen mNGS was 0.916(95%CI:0.822-1.000,P=0.000)with Youden index 0.832,while the AUC of conventional pathogen testing was 0.806(95%CI:0.674-0.938,P=0.000)with Youden index 0.612.

本研究35例患者根據(jù)送檢腦脊液病原mNGS測序的客觀標準進行評分，其中，0為4例，1為2例，2為8例，3為4例，4為6例，5為4例，6為7例；17例經腦脊液病原mNGS測序陽性證實診斷的患者，2為1例，3為3例，4為4例，5為3例，6為6例。計算 不同評分下mNGS測序陽性符合率并繪制曲線，可見隨著評分的增加，mNGS測序陽性符合率呈升高趨勢（圖2），其中評分≥3組mNGS測序陽性符合率高于評分＜3組且差異有統(tǒng)計學意義（16/21對1/14；Fisher確切概率法：P=0.000）。

圖2 隨著送檢腦脊液病原mNGS測序客觀標準評分的增加，mNGS測序陽性符合率呈升高趨勢Figure 2 Positive coincidence rate of mNGS showed an overall trend of increase with higher score of objective inclusion criteria for sending pathogen mNGS of CSF.

討 論

mNGS測序可以對病原微生物進行高通量篩查以發(fā)現(xiàn)未知感染，對疾病診斷與治療方案的制定具有重要意義，且相較于傳統(tǒng)病原學檢測，可以更快獲得檢測結果，為患者獲得更良好預后爭取機會。mNGS測序作為感染性疾病的診斷方法，可高敏感性 檢 出多部位感 染，包 括神經系統(tǒng)［1，13-14］、血 液［15］、呼吸道［16］、胃腸道［17］、泌尿系統(tǒng)［18］和眼部［19］等，還可以對細菌、病毒、真菌和寄生蟲等各類廣泛病原體進行篩查［20］，該項技術在中樞神經系統(tǒng)感染性疾病中也發(fā)揮重要作用。既往不乏腦脊液病原mNGS測序明確診斷罕見或臨床癥狀不典型的中樞神經系統(tǒng)感染的報道，如偽狂犬病毒致腦炎［21］、人類細小病毒B19相關病毒性腦炎［22］、中間型鏈球菌致腦膿腫［23］、廣州管圓線蟲致腦炎［24］等。

腦脊液病原mNGS測序的高敏感性和特異性業(yè)已得到廣泛證實。Xing等［25］的前瞻性研究評價腦脊液病原mNGS測序在腦炎和腦膜炎中的診斷效能，并首次根據(jù)其檢出的序列數(shù)繪制ROC曲線再計算各序列數(shù)的曲線下面積以確定mNGS測序的陽性閾值，結果顯示，腦脊液病原mNGS測序可以有效識別中樞神經系統(tǒng)感染病原體，檢出序列數(shù)≥5或10時，細菌性腦膜炎的診斷效能最佳（曲線下面積為0.846，95%CI：0.711～0.981）；檢出序列數(shù)≥2時，隱球菌性腦膜炎和腦曲霉病的靈敏度分別為76.92%和80%。Yan等［8］對結核性腦膜炎患者同時行腦脊液抗酸桿菌培養(yǎng)、結核分枝桿菌培養(yǎng)、實時熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）、結核分枝桿菌及利福平快速耐藥檢測（Xpert MTB/RIF）、mNGS測序，以臨床最終診斷為參照，腦脊液病原mNGS測序的診斷靈敏度（84.4%）高于抗酸桿菌培養(yǎng)（0，P=0.000）、結核分枝桿菌培養(yǎng)（22.2%，P=0.000）、實時FQ-PCR反應（24.4%，P=0.000）和Xpert MTB/RIF檢測（40%，P=0.000）；進一步繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)腦脊液蛋白定量和白細胞計數(shù)與mNGS測序陽性率呈正相關關系，即蛋白定量越高、白細胞計數(shù)越高，mNGS陽性檢出率越高。Zhang等［6］的研究納入疑似中樞神經系統(tǒng)感染患者，對比分析腦脊液病原mNGS測序與傳統(tǒng)病原學檢測（包括腦脊液常規(guī)和生化，細菌、真菌和結核分枝桿菌培養(yǎng)和涂片，自身免疫抗體和乳膠凝集試驗，以及血清病原體抗體測定，組織活檢術，核酸擴增試驗等）的診斷效能，發(fā)現(xiàn)mNGS測序在中樞神經系統(tǒng)感染中表現(xiàn)出令人滿意的診斷效能，其陽性檢出率高于傳統(tǒng)病原學檢測。本研究腦脊液病原mNGS測序對中樞神經系統(tǒng)感染的診斷靈敏度為17/19、特異度15/16，假陽性率為1/16、假陰性率2/19，準確度為91.43%，與既往文獻報道的該項技術特異性高于敏感性相符［25］。進一步繪制ROC曲線，腦脊液病原mNGS測序的曲線下面積為0.916、傳統(tǒng)病原學檢測為0.806，盡管二者診斷效能差異無統(tǒng)計學意義，但值得指出的是，mNGS測序較細菌培養(yǎng)等傳統(tǒng)病原學檢測方法節(jié)約了大量時間。

近年來，mNGS測序技術迅速發(fā)展，已成為感染性疾病的重要診斷方法，高通量特點使其具有獨特優(yōu)勢，但局限性也同樣來自高通量，深度測序檢出的微生物可能來自無致病性的正常菌群，目前對此類背景微生物的界定暫無統(tǒng)一標準，測序結果的判讀尚待進一步規(guī)范統(tǒng)一；此外，疾病早期藥物治療也可能影響結果判讀，因此，mNGS測序技術的應用應緊密結合臨床實際。

本研究還分析mNGS測序陽性符合率與送檢腦脊液病原mNGS測序客觀標準評分的關系，結果顯示，隨著評分的增加，mNGS測序陽性符合率總體呈升高趨勢。本組19例臨床最終診斷中樞神經系統(tǒng)感染的患者中僅2例mNGS測序結果未能提示感染來源，評分分別為2和3；再以評分3為分界點，評分≥3組mNGS測序陽性符合率高于評分＜3組?；谏鲜鼋Y果，筆者研究團隊提出了腦脊液病原mNGS測序的送檢標準為：（1）精神狀態(tài)改變（定義為意識水平下降或改變、嗜睡或人格改變）的持續(xù)時間≥24小時。（2）癲發(fā)作，除外既往癲或者單純熱性驚厥。（3）發(fā)病前或發(fā)病后72小時內記錄到體溫≥38℃。（4）出現(xiàn)新的局灶性神經系統(tǒng)癥狀。（5）腦脊液白細胞計數(shù)≥5/mm3。（6）影像學顯示的腦實質新發(fā)病灶提示腦炎。（7）腦電圖異常提示腦炎。每項標準賦值為1，評分≥3可考慮行腦脊液病原mNGS測序。送檢前應盡可能排除其他疾病，主要是自身免疫性腦炎。

本研究還出現(xiàn)評分為3患者mNGS測序陽性符合率高于評分為4患者（3/4對4/6）的反常現(xiàn)象，考慮可能是由于本研究數(shù)據(jù)來自單中心且樣本量相對較小所致；此外，盡管本研究的納入標準主要參照2013年國際腦炎聯(lián)盟共識［9］，但未參照該共識采取分層設置，也未重新分配各項權重，尚待在未來的多中心研究中進一步擴大樣本量、確定各項送檢標準的權重。同時也提醒廣大臨床醫(yī)師應盡可能同步送檢或留取腦脊液行病原mNGS測序和傳統(tǒng)病原學檢測，最終做到腦脊液mNGS測序送檢有的放矢、結果有據(jù)可依，以為中樞神經系統(tǒng)感染性疾病的精準診斷與治療提供更加有力的保障。

利益沖突無