韋頌禧，王紅磊，韋紅巧

(1. 前海人壽廣西醫(yī)院麻醉科，廣西 南寧 530200；2. 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

由腦血管病及其危險因素所引起的臨床卒中或者亞臨床血管性腦損傷，并至少涉及一個認(rèn)知域受損害的臨床綜合征，稱為血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)[1]。VCI被認(rèn)為是癡呆的第二大最常見原因[2]。VCI 雖然是迄今為止唯一可有效防治的癡呆類型，但其防治仍然無理想藥物，因此尋找安全有效的藥物尤為重要。右美托咪定是廣泛應(yīng)用于臨床麻醉的一種新型麻醉藥品，研究表明其在多種腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可改善認(rèn)知功能障礙和減少術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率[3-5]。但關(guān)于右美托咪定對VCI的作用及相關(guān)研究甚少，本研究旨在探討右美托咪定對VCI的改善作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 30只SD大鼠、SPF級、雄性，體重為(255±15) g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。合格證號：SCXK(桂)2003-0003。鹽酸右美托咪定注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn))，SOD、MDA和GSH-Px試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司Solarbio)，IL-6、IL-1β、TNF-α試劑盒(購自武漢華美生物工程有限公司CUSABIO)，TUNEL試劑盒(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2動物分組及VCI大鼠模型制備 將30只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和右美托咪定組，每組10只。通過永久結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈建立VCI大鼠模型：大鼠稱重后，10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定，常規(guī)備皮消毒，沿頸頂正中線切開皮膚，分離雙側(cè)頸總動脈，用1號絲線雙重結(jié)扎(結(jié)扎遠(yuǎn)近端)，并從中間剪斷頸總動脈，最后皮膚縫合并消毒，待大鼠蘇醒后，放回籠中進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，其余手術(shù)過程相同。術(shù)后死亡的大鼠被剔除出本研究，并補(bǔ)足相應(yīng)的大鼠數(shù)目。通過Morris水迷宮檢測大鼠的認(rèn)知功能是否損害，而判斷VCI模型建立是否成功。

1.3藥物治療 各組大鼠在溫度和濕度可控動物房內(nèi)正常飼養(yǎng)28 d后，右美托咪定組大鼠按20 μg/kg腹腔注射右美托咪定，模型組及假手術(shù)組給予等量生理鹽水腹腔注射，1次/天，連續(xù)給藥14 d。

1.4大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的檢測 末次給藥12 h后采用Morris水迷宮檢測各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。正式檢測前，先讓大鼠適應(yīng)環(huán)境。定位航行實(shí)驗(yàn)：將不透明平臺(直徑10 cm)放置于西北象限中心，低于水面1.5 cm處，分別從4個不同象限將大鼠面朝壁池放入水，記錄大鼠找到平臺的時間(即逃避潛伏期)。若120 s內(nèi)大鼠未找到平臺，由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)其至平臺上并停留20 s，逃避潛伏期記錄為120 s。將4個不同象限入水的逃避潛伏期求出平均值，記為當(dāng)天的檢測結(jié)果，作為空間學(xué)習(xí)能力的成績。測試歷時5 d，每天訓(xùn)練1次?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：定位航行試驗(yàn)結(jié)束24 h后，撤除站臺，大鼠從原平臺所在象限的對側(cè)象限入水，記錄大鼠首次穿越平臺區(qū)域的時間(逃避潛伏期)和120 s內(nèi)穿過原平臺所在位置的次數(shù)。

1.5腦組織MDA的含量及SOD、GSH-Px活性測定 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉大鼠，快速斷頭，低溫取全腦，分離雙側(cè)皮質(zhì)和海馬。取左側(cè)皮質(zhì)稱重，按試劑盒要求制成10%的勻漿，ELISA法檢測腦組織中MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6腦組織中炎癥因子的檢測 取海馬組織稱重，按試劑盒要求制成10%的勻漿，采用ELISA法檢測大鼠海馬組織勻漿液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7HE染色 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)心臟灌注0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛后斷頭取腦。分離海馬和皮質(zhì)，放置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫水后，行HE染色，光鏡下觀察皮質(zhì)、海馬部位病理學(xué)改變。

1.8TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 取常規(guī)石蠟切片，然后按TUNEL檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個高倍鏡視野(×400)觀察計(jì)數(shù)，以細(xì)胞核呈棕褐色為TUNEL陽性細(xì)胞，取陽性細(xì)胞率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1右美托咪定對VCI大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，目的是為了判斷空間的學(xué)習(xí)和記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期在第2～5天明顯延長(P<0.001)；與模型組比較，右美托咪定組大鼠第2～5天的逃避潛伏期均有所縮短(P<0.001)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期延長且穿越原平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.001)；與模型組比較，右美托咪定組大鼠的逃避潛伏期縮短(P<0.001)、穿越原平臺的次數(shù)增多(P<0.001)。見表1、表2。

表1 3組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期比較 單位：s

表2 3組大鼠空間探求實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2右美托咪定對VCI大鼠腦組織MDA含量、SOD、GSH-Px活性變化的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中MDA的含量增加(P<0.01)，同時SOD和GSH-Px的活性下降(P<0.01)；右美托咪定組大鼠腦組織中MDA含量下降，而SOD和GSH-Px的活性增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見表3。

表3 3組大鼠腦組織MDA含量、SOD及GSH-Px酶活性比較

2.3右美托咪定對VCI大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α的含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組的大鼠腦組織中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均升高(P<0.01)；給藥14 d后，與模型組比較，右美托咪定組大鼠的腦組織中中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均下降(P<0.01)，見表4。

表4 3組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量比較 單位：pg·ml-1

2.4右美托咪定對VCI大鼠腦組織病理學(xué)改變的影響 假手術(shù)組大鼠的皮質(zhì)、海馬的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，核圓潤，核染色質(zhì)均勻清楚，海馬的神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞間隙正常；模型組大鼠皮質(zhì)、海馬的神經(jīng)細(xì)胞核固縮、濃染甚至破裂，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死、消失，海馬的神經(jīng)元排列紊亂稀疏，組織間隙腫脹；給藥14 d后，與模型組比較，右美托咪定組大鼠皮質(zhì)、海馬的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改善，細(xì)胞核固縮程度減小，壞死細(xì)胞數(shù)量減少，海馬的神經(jīng)元排列整齊，見圖1。

注：A為假手術(shù)組皮質(zhì)，B為模型組皮質(zhì)，C為右美美托咪定組皮質(zhì)，D為假手術(shù)組海馬，E為模型組海馬，F(xiàn)為右美托咪定組海馬。

2.5右美托咪定對VCI大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響 通過光鏡觀察，可見凋亡細(xì)胞(陽性細(xì)胞)呈棕褐色，而陰性細(xì)胞呈紫色。模型組大鼠皮質(zhì)及海馬的神經(jīng)元凋亡較假手術(shù)組增加(P<0.001)；但給藥14 d后，右美托咪定組大鼠皮質(zhì)及海馬的神經(jīng)元凋亡較模型組下降(P<0.001)，見圖2。

注：a：與假手術(shù)組比較，P<0.001；b：與模型組比較，P<0.001。

3 討論

VCI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體的損傷及細(xì)胞凋亡等在VCI的病理生理過程中起重要作用[6-8]。當(dāng)組織缺血缺氧可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷、死亡，尤其海馬、皮質(zhì)等重要功能區(qū)域的損傷，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙[9-11]。多項(xiàng)研究表明[12-14]，通過抑制腦組織的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，均可以改善VCI所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，右美托咪定對多種腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)的作用，其已知的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制包括：抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡及抗興奮性神經(jīng)毒性等[15]。但右美托咪定是否對VCI具有保護(hù)作用及改善其認(rèn)知功能少見相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立VCI大鼠模型，觀察右美托咪定對VCI大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。

永久結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈導(dǎo)致慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)模型是研究VCI的經(jīng)典動物模型，其能較好地模擬人慢性腦血流灌注不足造成的腦組織處于低灌注和低氧狀態(tài)，從而引起海馬、皮質(zhì)等重要功能區(qū)域的損傷，使大鼠的學(xué)習(xí)能力及記憶力降低[16-17]。故本實(shí)驗(yàn)采用此方法建立VCI大鼠模型。經(jīng)Morris水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)，在定位巡航實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠的逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長，在之后的空間探索實(shí)驗(yàn)中與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期延長、穿越原平臺的次數(shù)明顯減少，提示大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，說明本實(shí)驗(yàn)VCI大鼠模型建立成功。腦內(nèi)生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均升高，SOD和GSH-Px 水平顯著減少，而MDA 含量顯著增加，提示VCI大鼠腦組織存在有炎癥反應(yīng)增強(qiáng)和氧化應(yīng)激。此外，模型組大鼠的皮質(zhì)及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組增加，VCI大鼠腦組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡參與了VCI的病理生理過程，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生，與文獻(xiàn)[11，18]報(bào)道一致。

經(jīng)過連續(xù)14 d腹腔注射給予右美托咪定后，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，右美托咪定組大鼠Morris水迷宮的逃避潛伏期縮短而穿越原平臺的次數(shù)增多，提示VCI大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力得到了改善，說明右美托咪定可以改善VCI大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能；與模型組比較，大鼠的腦組織中中IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA的含量均下降，而SOD和GSH-Px的活性增加，表明右美托咪定可以抑制VCI大鼠的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，從而對VCI大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用。此外，右美托咪定組大鼠皮質(zhì)及海馬的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較模型組顯著下降，皮質(zhì)及海馬神經(jīng)細(xì)胞的病理損傷明顯減輕，說明右美托咪定可以抑制VCI大鼠腦組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦組織損傷，維護(hù)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而改善VCI大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

綜上所述，右美托咪定對VCI大鼠的學(xué)習(xí)記憶有改善作用，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激和減輕細(xì)胞凋亡有關(guān)，但具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。