陳 瑤 湯建新 唐 英,

1. 湖南工業(yè)大學(xué)

生命科學(xué)和化學(xué)學(xué)院

生物醫(yī)用納米材料與器件

湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

湖南 株洲 412007

2. 湖南大學(xué)

化學(xué)化工學(xué)院

化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)

國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

湖南 長沙 410082

1 研究背景

氯氮平（clozapine）是常見的非典型抗精神病藥物[1]。根據(jù)藥物一致性評(píng)價(jià)的要求，制劑處方中原料藥及各輔料的含量需與參比制劑（reference listed drug，RLD）保持一致。醫(yī)藥研發(fā)技術(shù)需要保密，因而醫(yī)藥企業(yè)只公示氯氮平參比制劑的輔料種類，并無輔料的相關(guān)用量。故利用逆向工程研究技術(shù)，測出相關(guān)輔料的含量，對氯氮平一致性評(píng)價(jià)項(xiàng)目的處方研究具有重要意義[2]。

乳糖是存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物乳中的天然二糖，由半乳糖和蔗糖組成[3]。乳糖因其安全性高，廣泛用于片劑和膠囊劑的填充劑或稀釋劑[4]、靜脈注射劑、凍干產(chǎn)品和嬰兒食品配方中。不同粒度的乳糖具有不同的作用，如片劑濕法制粒及伴有研磨混合的過程時(shí)，宜選擇細(xì)小粒度級(jí)別的乳糖，這樣更易于與其他成分混合，也可更有效發(fā)揮黏合劑的作用[5]。氯氮平作為口服制劑，工藝配方中也需加入了一定比例的乳糖作為填充劑。乳糖作為氯氮平不可或缺的輔料，確定其含量，可為氯氮平片劑工藝處方的開發(fā)提供有效數(shù)據(jù)，從而加快氯氮平片劑的仿制速度。

乳糖無紫外吸收能力。目前其檢測方法有碘量法[6]、滴定法[7]、酶解法[8]、比色法[9]、旋光儀法[10]、近紅外光譜法[11-12]、拉曼光譜法[13]，以及高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）與示差折光檢測器[14-18]、蒸發(fā)光散射檢測器[19-20]、質(zhì)譜檢測器[8,21]、電噴霧檢測器[22]等串聯(lián)的方法。其中，碘量法、酶解法、滴定法、旋光儀法，這些方法存在操作復(fù)雜、技術(shù)要求高、測試時(shí)間長、靈敏度不足、準(zhǔn)確度較低的問題；近紅外光譜法及拉曼光譜法需結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)建立定量模型，模型的建立需要大量樣品和預(yù)先測定目標(biāo)值，成本較高；高效液相色譜與示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電噴霧檢測器、質(zhì)譜檢測器等串聯(lián)的方法具有靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但該類儀器設(shè)備昂貴，制約其在中小型醫(yī)藥企業(yè)的廣泛應(yīng)用。因此，發(fā)展一種成本低、快速、靈敏的乳糖檢測技術(shù)具有重要意義。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolinone，PMP）可與乳糖發(fā)生衍生反應(yīng)（見圖1），其衍生產(chǎn)物具有較強(qiáng)的紫外吸收能力，從而可通過高效液相色譜-紫外檢測器（ultraviolet absorption detector，UV）對乳糖進(jìn)行間接檢測[23-24]。目前，HPLC-UV普及率高且經(jīng)濟(jì)，實(shí)驗(yàn)操作簡單，準(zhǔn)確度高。雖然HPLC-UV廣泛用于中藥材、食品、生物材料中乳糖含量的檢測，但其應(yīng)用于仿制藥業(yè)領(lǐng)域的報(bào)道尚少。

圖1 乳糖和PMP反應(yīng)過程及液相檢測模擬Fig. 1 Lactose derivatization simulation with PMP and the detection principle of HPLC

綜上所述，本研究利用PMP與乳糖進(jìn)行衍生反應(yīng)，再對衍生物（在245 nm處有紫外吸收）進(jìn)行檢測，間接定量分析氯氮平片中乳糖的含量。該方法具有簡便、快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可滿足氯氮平一致性評(píng)價(jià)中逆向工程研究的需求，進(jìn)而加快仿制藥的研發(fā)進(jìn)程。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要設(shè)備與儀器、試劑與材料

1）設(shè)備與儀器

分析天平，XSE105DU型，瑞士Mettler Toledo集團(tuán)；水浴鍋，DF-101S型，鄭州豫華儀器制造有限公司；高效液相色譜儀，Waters e2695-2998型，美國Waters公司；色譜工作站，Empower 3型，美國Waters公司；純水儀，Exceed-Ad-32型，成都艾柯分析設(shè)備有限公司；超聲清洗儀，SB-5200D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；pH計(jì)，PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

2）試劑與材料

乳糖、磷酸，均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、氨水，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；醋酸銨，分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，德國默克公司；氯氮平片參比制劑，批號(hào)為T17039，規(guī)格為25 mg，諾華集團(tuán)；氯氮平片仿制樣品，批號(hào)為190701、190705、190708，規(guī)格為25 mg，湖南中南制藥有限公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件

采用Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.1 mol/L醋酸銨溶液，用磷酸調(diào)節(jié)溶液pH至5.5，流動(dòng)相B為乙腈，流速為1.0 mL/min，檢測波長為245 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL，按照表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 HPLC mobile phase gradient elution condition

2.2.2 溶液配制

1）空白基質(zhì)：按照自研氯氮平處方混合相關(guān)輔料制得（無乳糖）。

2）衍生溶液：精確稱量2.000 76 g PMP至100 mL容量瓶，再加入甲醇經(jīng)超聲溶解，定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為20.007 6 mg/mL的衍生溶液。

3）衍生空白溶液：稱量12.05 mg空白基質(zhì)至50 mL容量瓶，精確加入4.0 mL 20.007 6 mg/mL的PMP衍生溶液、1.0 mL純水和0.4 mL氨水，90 ℃水浴中衍生30 min，冷卻至室溫，用甲醇定容，搖勻，過濾，即得。

4）對照溶液：分別精確稱量220.95 mg和220.43 mg空白基質(zhì)至20 mL容量瓶中，分別向容量瓶中加入200.05 mg和199.97 mg乳糖，加適量的水經(jīng)超聲溶解，定容后作為儲(chǔ)備溶液；再精確移取1.0 mL儲(chǔ)備溶液、0.4 mL氨水、4.0 mL 20.0076 mg/mL的PMP衍生溶液至50 mL容量瓶中，90 ℃水浴中衍生30 min，冷卻至室溫，再用甲醇定容，搖勻，過濾，即得。

5）供試品溶液：隨機(jī)選取2片氯氮平片（需稱量質(zhì)量）至20 mL容量瓶中，加適量的水經(jīng)超聲至完全溶解，定容后作為儲(chǔ)備溶液；再移取1.0 mL上述儲(chǔ)備溶液至50 mL容量瓶中，加入0.4 mL氨水和4.0 mL 20.007 6 mg/mL 的PMP衍生溶液，90 ℃水浴中衍生30 min，冷卻至室溫，用甲醇定容，搖勻，過濾，即得。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

移取1.0 mL 10.039 mg/mL的乳糖溶液和1.0 mL 2.5 mg/mL氯氮平溶液至50 mL容量瓶中，再加入4.0 mL 20.001 1 mg/mL的PMP衍生溶液和0.4 mL氨水，90 ℃水浴中加熱30 min，取出冷卻至室溫，用甲醇定容，作為供試品溶液，用于色譜條件優(yōu)化。供試品溶液經(jīng)過衍生反應(yīng)后，進(jìn)行等度洗脫分離，結(jié)果顯示衍生物保留時(shí)間約為22 min，氯氮平峰在35 min之內(nèi)未出峰。為提高分析效率，將色譜條件調(diào)整為梯度洗脫，按照最佳梯度洗脫條件（見表1）進(jìn)樣，得到衍生目標(biāo)峰、PMP和氯氮平的色譜峰如圖2所示。衍生目標(biāo)峰與PMP間分離度（R=7.0）良好，氯氮平峰在分析周期內(nèi)得以洗脫，且分析時(shí)間適中。

圖2 供試品樣品的衍生色譜圖Fig. 2 Chromatogram of the test sample derivatized by PMP

3.2 衍生條件的優(yōu)化

3.2.1 催化劑氨水用量的優(yōu)化

移取1.0 mL 10.008 mg/mL的乳糖溶液至50 mL容量瓶，再加入4.0 mL 20.003 4 mg/mL的PMP衍生溶液，做7份平行試樣，分別加入0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,1.5, 2.0 mL的氨水，90 ℃水浴中加熱30 min，取出冷卻至室溫，用甲醇定容。

不同體積的氨水（V1）對乳糖衍生目標(biāo)峰峰面積的影響曲線如圖3所示。由圖可知，隨著氨水用量的增加，衍生目標(biāo)峰的峰面積呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)氨水體積為0.4 mL時(shí)，衍生目標(biāo)峰的峰面積最大。所以氨水最優(yōu)體積選擇0.4 mL。

圖3 乳糖衍生目標(biāo)峰峰面積與氨水體積的關(guān)系圖Fig. 3 The peak area of lactose’s derivative to different volume of ammonia

3.2.2 衍生試劑PMP用量的優(yōu)化

移取1.0 mL 10.012 mg/mL的乳糖溶液至50 mL容量瓶，再加入0.4 mL氨水，做5份平行試樣，分別加入1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 mL質(zhì)量濃度為20.000 3 mg/mL的PMP衍生溶液，90 ℃水浴中加熱30 min，取出冷卻至室溫，用甲醇定容。

不同體積的PMP衍生溶液（V2）對乳糖衍生目標(biāo)峰峰面積的影響曲線如圖4所示。由圖可知，隨著PMP用量的增加，衍生目標(biāo)峰的峰面積增加幅度不明顯，呈現(xiàn)波動(dòng)變化。但當(dāng)PMP體積為4.0 mL時(shí)，衍生峰面積出現(xiàn)最大值，且當(dāng)PMP體積為5.0 mL時(shí)，衍生峰面積明顯減小。因此，最終選擇PMP衍生溶液體積為4.0 mL。

圖4 乳糖衍生目標(biāo)峰峰面積與PMP衍生溶液體積的關(guān)系圖Fig. 4 The peak area of lactose’s derivative to different volume of PMP

3.2.3 衍生溫度的優(yōu)化

移取1.0 mL 10.020 mg/mL 乳糖溶液至50 mL容量瓶中，再加入0.4 mL氨水和4.0 mL質(zhì)量濃度為20.001 7 mg/mL的PMP衍生溶液，做5份平行試樣，分別放置于50, 60, 70, 80, 90 ℃水浴中加熱30 min，取出冷卻至室溫后，用甲醇定容。

不同衍生溫度對乳糖衍生目標(biāo)峰峰面積的影響曲線如圖5所示。

圖5 乳糖衍生目標(biāo)峰峰面積與衍生溫度的關(guān)系圖Fig. 5 The peak area of lactose’s derivative to different temperatures

由圖5可知，隨著衍生溫度的增加，衍生目標(biāo)峰的峰面積不斷增加；當(dāng)水浴溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，衍生目標(biāo)峰的峰面積達(dá)到平臺(tái)期，說明該溫度下衍生反應(yīng)基本完成。但為使衍生反應(yīng)徹底并降低結(jié)果波動(dòng)性的影響，最終選擇90 ℃作為衍生溫度。

3.2.4 衍生時(shí)間的優(yōu)化

移取1.0 mL質(zhì)量濃度為10.000 7 mg/mL的乳糖溶液至50 mL容量瓶中，再加入0.4 mL氨水和4.0 mL質(zhì)量濃度為20.002 mg/mL的PMP衍生溶液，做7份平行試樣，90 ℃水浴中分別加熱15, 20, 25, 30,35, 40, 50 min，取出冷卻至室溫，用甲醇定容。

不同衍生時(shí)間對乳糖衍生目標(biāo)峰峰面積的影響曲線如圖6所示。由圖可知，在30 min前，衍生目標(biāo)峰的峰面積不斷增大；在30～40 min，峰面積呈現(xiàn)減小趨勢；過了40 min，峰面積又呈現(xiàn)增大趨勢。在50 min內(nèi)，衍生目標(biāo)峰的峰面積在30 min時(shí)達(dá)到最大值。故最優(yōu)的衍生時(shí)間為30 min。

圖6 乳糖衍生目標(biāo)峰峰面積與衍生時(shí)間的關(guān)系圖Fig. 6 The peak area of lactose’s derivative to different derivation time

3.3 實(shí)驗(yàn)方法的性能驗(yàn)證

3.3.1 系統(tǒng)精密度

按照2.2.2的方法配制對照溶液，重復(fù)進(jìn)樣對照溶液6針，計(jì)算6針衍生目標(biāo)物的峰面積和保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.85%和0.08%，由此說明進(jìn)樣系統(tǒng)的精密度良好。

3.3.2 穩(wěn)定性

按照方法2.2.2配制對照溶液和供試品溶液，將對照溶液和樣品溶液在室溫分別放置0, 2, 4, 8, 12, 24,36, 48 h后進(jìn)樣，計(jì)算衍生目標(biāo)峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.38%和0.48%。該結(jié)果表明對照溶液和供試品溶液在室溫48 h內(nèi)穩(wěn)定，后續(xù)批量制備溶液和進(jìn)樣可在室溫48 h內(nèi)完成。

3.3.3 專屬性

圖7為衍生空白溶液、對照溶液、氯氮平樣品溶液的色譜圖。由圖可以看出，PMP、乳糖衍生目標(biāo)物、氯氮平的保留時(shí)間分別為19.348 , 22.243, 29.484 min，各化合物之間分離度良好，且完全不干擾衍生目標(biāo)峰，由此說明該方法專屬性良好。

圖7 衍生空白溶液、對照溶液、氯氮平樣品溶液的色譜圖Fig. 7 Chromatogram of derivative blank solution,control solution and clozapine sample solution

3.3.4 線性范圍和定量限

以衍生目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)，乳糖的質(zhì)量濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)加入法的標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖8），其線性回歸方程為：y=41 856 509.560 5x+36 592.315 8，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0.060 4～0.399 7 mg/mL范圍內(nèi)，衍生目標(biāo)物的峰面積與乳糖質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。再將乳糖儲(chǔ)備溶液逐步稀釋后進(jìn)行衍生，直至信噪比（S/N）在10～20之間，得到乳糖定量限為0.32 μg/mL。

圖8 乳糖衍生目標(biāo)物的峰面積與濃度關(guān)系圖Fig. 8 The peak area of lactose’s derivative to different concentration

同時(shí)，將該方法與其他一些報(bào)道的乳糖檢測方法進(jìn)行比較（見表2）。本方法不需要昂貴的設(shè)備儀器、實(shí)驗(yàn)操作簡單、具有較寬的線性響應(yīng)范圍、準(zhǔn)確度高，能滿足氯氮平片中乳糖的檢測要求。

表2 不同方法檢測乳糖的檢出限和線性范圍Table 2 Detection limits and linear ranges of different methods for lactose detection

3.3.5 耐用性

將對照溶液和供試品溶液，分別按照流速（1.0±0.1）mL/min、柱溫（30±5）℃、檢測波長（245±2）nm改變色譜參數(shù)及換用不同品牌色譜柱進(jìn)樣對照溶液和供試品溶液，計(jì)算的乳糖含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04%，且目標(biāo)峰無相關(guān)干擾，由此說明本方法的耐用性及抗干擾性良好。

3.3.6 回收率

取9份供試品溶液，按照高、中、低3個(gè)水平添加乳糖作為加標(biāo)溶液，考察本方法的回收率，結(jié)果如表3所示。

表3 乳糖在空白基質(zhì)中的加標(biāo)回收率（n=9）Table 3 Spiked recoveries of hydrazine in blank substrate （n=9）

由表3可知溶液，其回收率在96.7%～99.2%，平均回收率為98.16%，RSD為0.81%。各個(gè)濃度水平的回收率結(jié)果均較好，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，由此說明本方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度高，重復(fù)性較好。

3.4 樣品檢測

按照處方，仿制3批（批號(hào)為190701, 190705,190708）乳糖含量已知的氯氮平片樣品和參比制劑（批號(hào)為T17039）樣品，按照上述方法衍生后測定乳糖含量，經(jīng)過換算得出4個(gè)批次乳糖含量及偏差如表4所示。

表4 自制處方和參比制劑中乳糖含量的測定結(jié)果Table 4 Determination results of lactose content in homemade prescription and reference preparation

從表4數(shù)據(jù)可知，本法測定的自制處方中乳糖含量實(shí)測值分別為42.09, 43.36, 43.45 mg/片，與處方含量的偏差均小于2.0 mg/片。參比制劑測得乳糖的含量為45.34 mg/片，但其對照含量40.39 mg/片是根據(jù)文獻(xiàn)[25]報(bào)道的，該文獻(xiàn)利用的是HPLC結(jié)合示差折光檢測器檢測氯氮平中乳糖的含量。因?yàn)闄z測器的不同、參比制劑的批間差異、方法測定誤差等原因，綜合導(dǎo)致參比制劑檢測結(jié)果中乳糖含量檢測偏差為4.95 mg/片。本文自制處方的檢測結(jié)果與實(shí)際處方含量相差較小，均小于2.0 mg/片，而文獻(xiàn)[25]檢測方法中自制檢測結(jié)果與其實(shí)際含量偏差在2.91 mg/片，較本法結(jié)果誤差偏大。且文獻(xiàn)中的檢測方法需要使用氨基柱這種特殊類型的色譜柱，其氨基柱的鍵合官能團(tuán)氨丙基容易水解，在進(jìn)行樣品檢測時(shí)，流動(dòng)相中水的比例較高，易引起氨丙基的水解，從而影響色譜柱的使用壽命。官能團(tuán)氨丙基帶有負(fù)電荷，在分析酸性物質(zhì)（如糖類）時(shí)，容易與帶質(zhì)子的酸性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使得氨基柱的柱效降低，影響檢測的結(jié)果，故需要對氨基柱進(jìn)行維護(hù)。本方法中使用的色譜柱填料為常規(guī)的C18填料，分析方法中水相比例可放寬調(diào)整，也不會(huì)因色譜柱維護(hù)不當(dāng)影響結(jié)果檢測。因此，利用本實(shí)驗(yàn)方法測定的參比制劑數(shù)值，可以加快一致性評(píng)價(jià)項(xiàng)目的處方研究，縮短研發(fā)周期和降低研發(fā)成本。

4 結(jié)論

藥物一致性評(píng)價(jià)要求仿制藥與參比制劑在劑型、處方、規(guī)格及給藥途徑等各方面保持一致。仿制藥同參比制劑越相似，生物等效性成功的可能性就越大。因此，本研究提出了柱前衍生HPLC-UV法，測定氯氮平片中乳糖含量，即用PMP作為衍生試劑與乳糖衍生后，用HPLC-UV法間接測定氯氮平中乳糖含量。該方法各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)符合中華人民共和國藥典的要求，具有經(jīng)濟(jì)、簡便、專屬性強(qiáng)及準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于氯氮平片中乳糖的含量測定，進(jìn)而可推廣到其他仿制藥中乳糖的逆向研究中。