李旻熹 陳增萍

湖南大學

化學化工學院

化學生物傳感與計量學

國家重點實驗室

湖南 長沙 410082

1 研究背景

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是一種高能磷酸化合物，作為生物體中化學能的主要載體，在調節(jié)細胞代謝、細胞內信號的傳遞和各種生理生化過程中都具有至關重要的作用[1-2]。已有報道表明，許多人體疾病如低血糖、缺氧、貧血、神經再生紊亂、惡性腫瘤等與ATP的異常代謝有關[3-4]。因此，準確檢測生物樣本中ATP的含量在生化研究和臨床診斷中具有重要意義。

核酸適配體（aptamer）是對目標物具有特異性識別能力的單鏈DNA或RNA。目標可以是小分子、蛋白質、病毒、細胞等[5-7]。由于適配體具有良好的選擇性和穩(wěn)定性，目前已經發(fā)展了多種基于適配體的ATP檢測方法，如：化學比色法[8]、電化學法[9]、化學發(fā)光法[10]、熒光光譜法[11-13]等。其中，利用熒光光譜法對生物體系中ATP進行定量檢測，充分結合了適配體特異性識別能力和熒光光譜靈敏度高、操作簡單、快速的優(yōu)點[14]。

熒光光譜法，通常是根據標準樣本的光譜數據，以特定波長下的光譜強度對目標物濃度建立單變量模型，從而對待測樣本中目標物濃度進行定量分析。而在實際待測體系中（如細胞液、血漿等），由于組成成分較為復雜，普遍存在背景干擾和基質效應。背景干擾可以通過減去待測樣本中空白溶液的光譜貢獻[15]或將標準樣本和待測樣本的光譜投影到與待測樣本背景光譜所張成空間的正交補空間[16]上進行消除。此外，對樣本進行適當預處理，可以一定程度上緩解因基質不同導致的光譜強度與目標物濃度之間嚴重偏離單變量校正模型的問題； 但繁瑣耗時的處理過程，在一定程度上會抵消熒光檢測分析快速的優(yōu)勢。分析化學領域通常采用經典標準加入法進行處理[17]。廣義標準加入法（generalized multivariate standard addition method，GSAM），在響應值和被分析物濃度間建立多項式關系模型：

式中R、K、C、ΔC和C0分別為響應值矩陣、系數矩陣、濃度矩陣、標準加入矩陣和未知濃度矩陣。

利用多次線性回歸，可以同時進行多組分分析求解[18-19]。標準加入法通常與單變量或多變量校正模型結合使用[20-21]，其要求被測樣本不包含具有光譜響應的背景干擾或具有和待測樣本相同的基質成分但不含目標物的空白溶液。然而以上兩點在實際檢測過程中通常很難達到。因此采用經典標準加入法與單變量模型相結合的方法，對實際待測樣本中目標物進行定量分析可能產生明顯誤差。此外，經典標準加入法通常需要4個以上加標樣本，限制了對微量樣本的定量分析。本文通過熒光標記的ATP適配體探針，結合基于探針技術的廣義標準加入多元校正策略[22]，解決復雜體系對熒光信號的干擾問題，從而實現對復雜體系中ATP的快速準確定量分析。

2 檢測原理與方法

2.1 檢測原理

基于探針技術的ATP檢測原理如圖1所示。實驗中使用的DNA序列分別為3末端標記6-羧基熒光素（6-carboxy-fluorescein，FAM）的探針序列ATP-F和5末端標記黑洞猝滅基團（black hole quencher 1，BHQ1）的ATP-Q。其中，ATP-F為ATP適配體，從3端開始與ATP-Q部分互補。

圖1 基于探針技術的ATP檢測原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram for the detection of ATP based on probe technique

反應體系中未加入ATP時，兩條DNA雜交形成雙鏈結構，FAM的熒光信號被BHQ1猝滅。當加入ATP反應時，ATP與ATP-F結合，使雙鏈結構發(fā)生解離，FAM的熒光信號得到恢復。

2.2 數據分析方法

為了準確測定實際樣本中ATP的含量，以標準樣本的熒光光譜建立了GSAMprobe模型。通過加標樣本的最小平均絕對百分比誤差（mean absolute percentage error，MAPE）來優(yōu)化并確定針對細胞裂解液和血清樣本的GSAMprobe模型參數。GSAMprobe的詳細說明如下。

假設xi（i=1, 2, …, N） 是第i個標準樣本的熒光光譜響應，它可以表示為ATP探針序列（ATP-F）3末端標記的FAM熒光基團的信號與背景信號的線性組合，即

式中：cFAM,i為第i個樣本中FAM的濃度；

rFAM為單位濃度的FAM熒光響應；

bi為反應溶液中可能存在的背景干擾，bi對所有樣本都是恒定的。

當目標物質ATP的濃度越高時，會與越多的探針序列形成復合物，破壞原本與互補序列（ATP-Q）形成的雙鏈結構，使FAM熒光信號得到恢復。因此，第i個樣本中FAM的濃度cFAM,i與ATP的濃度cATP,i之間存在線性關系，可以表示為

因此，可以將式（1）改寫為

實際待測樣本和它的加標樣本可類似地表示為

式（3）～（4）中：xtest為實際待測樣本熒光光譜響應；

xadd為標準加入樣本熒光光譜響應；

g為由于基質效應引起的熒光信號差異的參數；

cATP,test為實際待測樣本中ATP的濃度；

Δc為添加到加標樣本中的ATP標準溶液濃度；

bt為待測樣本的背景干擾。

待測樣本和標準樣本背景干擾的差異，可以通過將xi和xtest投影到bt所張成空間的正交互補空間來縮小。

通過偏最小二乘法（partial least-square method，PLS），在變換后的xi上建立多元校正模型[23]。待測樣本的PLS模型對ATP濃度的預測結果可以表示為

式中e0為待測樣本PLS模型的預測誤差。

加標樣本PLS模型的預測濃度為

式中ei為加標樣本PLS模型的預測誤差。

3 實驗

3.1 實驗試劑與藥品

核酸探針由大連寶生物工程有限公司合成，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）純化方式，具體序列為（ATP-F：5’-AACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTFAM-3’，ATP-Q： 5’-BHQ1-ACCTTCCTCCGCAA-3’）。ATP溶液、三磷酸鳥苷（guanosine-5’-triphosphate，GTP）溶液、三磷酸胞苷（cytidine-5’-triphosphate，CTP）溶液、三磷酸尿苷（uridine-5’-triphosphate，UTP）溶液，濃度均為100 mmol/L，購于上海生工生物工程股份有限公司。三羥基甲基氨基甲烷（Tris，純度為99.9%）、氯化鈉（NaCl）、氯化鎂（MgCl2）、鹽酸（HCl），均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。健康人血清購于長沙血站中心。肝癌細胞（HepG2）按常規(guī)方法培養(yǎng)。實驗中未特別說明的試劑純度均為分析純。所有試劑無需進一步純化，實驗用水均為滅菌水。

3.2 實驗儀器及參數設置

pH計，PHS-3C型，上海儀電科學儀器有限公司。

圓二色光譜儀，MOS-500型，法國Bio-Logic公司。圓二色測試條件設置：光譜狹縫寬度為5 nm，掃描波長范圍為210～320 nm，光譜掃描速度為300 nm/min，間隔0.5 nm記錄一個數據點，使用石英比色皿（10 mm，3.5 mL），緩沖溶液的背景從圓二色光譜中扣除。

熒光分光光度計，F-7000型，日本Hitachi公司。熒光測試參數設置：光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）電壓為900 V，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長范圍為500～650 nm，光譜掃描速度為240 nm/min，間隔1 nm記錄一個數據點。

3.3 實驗過程

1）細胞裂解液制備。選胰酶消化密度為105～106mL-1的細胞，加入3 mL的生理鹽水，移液器吹打混勻后1 000 r/min離心5 min收集細胞；用3 mL的生理鹽水漂洗一次，再次1 000 r/min離心5 min收集細胞；上清液棄去，加入200 μL超純水裂解細胞，凍存于-80 ℃冰箱。待完全解凍后，細胞將全部裂解。

2）模擬實際樣本制備。將細胞裂解液和血清分別稀釋100倍，向其中添加ATP母液，模擬樣本中ATP最終濃度為 200 μmol/L。

3）標準樣本制備。將ATP-F和ATP-Q分別加入適量滅菌水溶解，配制成濃度為1 μmol/L的工作液。將濃度為100 mmol/L的ATP母液加入適量滅菌水，配制成 200 μmol/L 的 ATP 工作液。將 10 μL ATP-F工作液、20 μL ATP-Q 工作液 、20 μL Tris-HCl緩沖液（200 mmol/L Tris，1.5 mol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2，pH值為7.2）、不同體積ATP 工作液充分混勻，并加滅菌水定容至200 μL，于37 ℃ 水浴反應2 h。最終標準樣本濃度分別為0, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65 μmol/L。

4）實際樣本配制。將10 μL ATP-F工作液、20 μL ATP-Q工作液、20 μL Tris-HCl緩沖液、不同體積ATP 工作液、20 μL HepG2細胞裂解液或血清模擬樣本，充分混勻并加滅菌水定容至200 μL，于37 ℃ 水浴反應2 h。細胞樣本和血清樣本中添加的ATP最終濃度分別為 10, 30 μmol/L。

4 結果與討論

4.1 實驗可行性

通過熒光光譜和圓二色光譜，對實驗的可行性分別進行了驗證。不同溶液的熒光光譜和圓二色光譜分別如圖2和圖3所示。

圖2 不同溶液的熒光光譜Fig. 2 Fluorescence emission spectra of different mixtures

圖3 不同溶液的圓二色光譜Fig. 3 Circular dichroism spectra of different mixtures

從圖2的熒光光譜圖中可以看出，反應體系中未加入ATP反應時，520 nm處未發(fā)現明顯的熒光信號，與緩沖溶液的背景信號基本一致，說明FAM的熒光信號被BHQ1完全猝滅。當加入ATP反應時，520 nm處有明顯的熒光信號，說明ATP與適配體結合破壞了雙鏈結構的穩(wěn)定性，使FAM的熒光信號得到恢復。圖3中的圓二色光譜也進一步驗證了上述結論。

從圖3的圓二色光譜圖可看出，反應體系中未加入ATP反應時，在243 nm和276 nm處獲得很強的圓二色吸收峰，這是DNA雙鏈的特征峰。加入ATP反應后，光譜形狀發(fā)生了改變，圓二色吸收峰遷移至258 nm和281 nm處。根據文獻[24]報道，這是由于ATP和適配體作用后，導致適配體形成反平行G-四聯體結構的特征峰。這表明ATP可以與互補鏈ATP-Q競爭結合適配體ATP-F用于ATP濃度的檢測。

4.2 DNA雜交比例優(yōu)化

ATP-F和ATP-Q的雜交比例對ATP的檢測性能有很大影響。ATP-Q對ATP-F的雜交比值過小，會導致FAM信號猝滅不完全，使得背景信號增大；反之比值過大，會影響ATP與適配體的結合。實驗中，固定ATP-F濃度為50 nmol/L和不同濃度的ATP-Q雜交，記錄加入ATP（1 mmol/L）反應后，熒光信號強度（F）與空白樣本熒光信號強度（F0）的比值，結果如圖4所示。

圖4 熒光強度比值與DNA雜交濃度比的關系Fig. 4 Relationship between fluorescence intensity ratio and DNA hybridization ratio

由圖4可知，當ATP-Q和ATP-F雜交濃度比為2:1時，熒光信號比值達到較大值，且當雜交濃度比繼續(xù)增大，信號比變化趨于平衡。因此，最終選擇ATP-Q和ATP-F雜交濃度比為2:1。

4.3 反應時間優(yōu)化

在ATP-F濃度為50 nmol/L和ATP-Q濃度為100 nmol/L的5個平行樣本中，均加入濃度為1 mmol/L的ATP分別反應不同時間，并記錄反應后熒光信號強度（F）與空白樣本熒光信號強度（F0）的比值，結果如圖5所示。由圖5可知，當反應時間為2 h時，熒光信號強度比值最大，因此最終選擇2 h作為與ATP的反應時間。

圖5 熒光強度比值與反應時間的關系Fig. 5 The relationship between fluorescence intensity ratio and reaction time

4.4 反應體系對ATP的選擇性

為了驗證實驗反應體系對ATP的選擇性，選擇了3種常見的ATP類似物（CTP、GTP、UTP）以及類似物與ATP的混合物代替ATP加入到反應體系中。通過比較反應后熒光信號強度（F）與空白樣本熒光信號強度（F0）的比值變化，判斷反應體系對ATP的選擇性，結果如圖6所示。

圖6 不同溶液反應前后熒光強度比值對比Fig. 6 Comparison of fluorescence intensity ratio before and after the reaction of different solutions

由圖6可知，添加ATP類似物（濃度為500 μmol/L）不會引起明顯的光譜強度變化，和空白樣本的熒光信號強度比值基本一致。添加ATP（濃度為50 μmol/L）能使反應前后的熒光比值發(fā)生明顯變化，類似物與ATP的混合物同樣能引起熒光比的變化，并且比值基本與ATP相同，說明類似物對反應體系不會造成顯著干擾。這說明該反應體系對ATP具有良好的選擇能力。

4.5 F/F0隨ATP濃度線性變化的范圍

在反應體系中改變ATP的濃度，考察加入ATP和未加入ATP反應時熒光信號強度的比值（F/F0）與ATP濃度的關系，結果如圖7所示。由圖7可知，在ATP濃度為0～100 μmol/L的范圍內，F/F0隨ATP濃度的增大而逐漸增大；ATP的濃度進一步增大至100～200 μmol/L范圍時，F/F0趨于平穩(wěn)，沒有明顯改變。如插圖所示，在5～65 μmol/L的濃度范圍內，F/F0與ATP的的濃度具有良好的線性關系，相關系數為R2=0.987。

圖7 熒光信號強度比與ATP濃度的關系Fig. 7 The relationship between fluorescence intensity ratio and ATP concentration

4.6 實際樣本中ATP的定量分析

用傳統(tǒng)單變量模型、偏最小二乘法（PLS）和GSAMprobe模型，對HepG2細胞裂解液和血漿樣本進行檢測，結果如表1～2所示。

表1 使用1個標準加入樣本時3種方法的檢測結果Table 1 Quantitative results of 3 methods when using 1 standard addition sample

由表1可知，由于細胞裂解液和血漿會對光譜信號強度產生干擾，PLS和傳統(tǒng)單變量模型的預測結果與實際含量存在明顯偏差；相比之下，僅使用1個標準加入樣本的GSAMprobe模型，能準確預測細胞液和血漿樣本中ATP的濃度，定量分析結果優(yōu)于其他兩種方法。

對比表1和表2的結果可知，增加標準加入樣本的數量，能適當提高GSAMprobe模型定量檢測結果的準確性；但1個標準加入樣本足以使GSAMprobe模型提供令人滿意的定量分析結果，這對于檢測微小體積或珍惜樣本很有意義。

表2 使用2個標準加入樣本時3種方法的檢測結果Table 2 Quantitative results of 3 methods when using 2 standard addition samples

5 結語

用光化學生物傳感技術對復雜樣本中目標物進行定量分析時，由于樣本組成成分通常較為復雜，光譜信號容易受到樣本中未知物質的干擾，從而對定量檢測結果的準確性造成影響。本文利用基于探針技術的廣義標準加入多元校正策略，結合熒光標記的ATP探針，以細胞裂解液和血漿為復雜樣本模擬體系，對其中的ATP進行定量分析。實驗結果表明，1個標準加入樣本足以解決復雜實際樣本對熒光信號造成干擾的問題，且能對實際樣本中ATP的濃度進行準確定量。同時，相較于傳統(tǒng)標準加入法，該方法所需的待測樣本體積更小。因此，該校正策略有望應用于其他微量復雜樣本或珍惜樣本中目標物的快速、準確地定量分析。