陳志祥，羅小燕，李拴林，吳如月，王文強(qiáng)，丁西朋*

(1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570288；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 海口 571101；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

木豆(Cajanuscajan)起源于印度，為全球第6大食用豆類，全世界種植面積約464萬hm2，是世界半干旱地區(qū)居民蛋白質(zhì)的主要來源[1]。在我國云南、廣西、海南、江西、貴州等南方省區(qū)均有栽培，現(xiàn)有面積約2萬hm2[2]。木豆葉片富含蛋白，是優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料；木豆根系發(fā)達(dá)、固氮能力強(qiáng)，是理想的植被恢復(fù)和土壤改良樹種[3]。木豆藥用價(jià)值很高，有清熱解毒、治療水痘、瘧疾和股骨頭壞死等功效[4]。因此，木豆兼具生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，開發(fā)利用前景很大，開展木豆種質(zhì)資源多樣性分析具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。

種質(zhì)資源是作物育種的基礎(chǔ)，開展種質(zhì)資源的遺傳背景、遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析對作物遺傳育種和種質(zhì)資源收集、保存鑒定具有重要的指導(dǎo)意義[6]。形態(tài)指標(biāo)觀測及分析是作物種質(zhì)資源遺傳多樣性研究最傳統(tǒng)、最直觀的方法，是早期育種家獲取作物種質(zhì)資源間遺傳差異的重要途經(jīng)。但作物形態(tài)指標(biāo)觀測結(jié)果受環(huán)境影響大、穩(wěn)定性差、周期長，嚴(yán)重影響了作物種質(zhì)資源遺傳背景研究的進(jìn)展和準(zhǔn)確性[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，AFLP，RAPD，SRAP等分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為研究作物種質(zhì)資源遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)的重要手段[8]。相對于AFLP，RAPD和SRAP標(biāo)記，SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，已在水稻(Oryzasativa)[9]、大豆(Glycinemax)[10]等多種作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析上應(yīng)用[11]。國外學(xué)者開展了大量的木豆種質(zhì)資源收集、核心種質(zhì)構(gòu)建及遺傳多樣性評價(jià)[12-14]，但針對國內(nèi)木豆種質(zhì)資源的相關(guān)研究較少，僅見康智明等[15]、高桂娟和李志丹[16]通過形態(tài)性狀指標(biāo)分別對10份和45份木豆種質(zhì)進(jìn)行了多樣性分析，閆龍等[17]和郭蓓等[18]分別利用AFLP和RAPD標(biāo)記對木豆資源進(jìn)行了多樣性分析。因此，為滿足國內(nèi)木豆資源研究及創(chuàng)新利用的需求，有必要進(jìn)一步開展木豆種質(zhì)資源遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。本研究利用已報(bào)道的SSR標(biāo)記對72份木豆種質(zhì)資源材料的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，從而為木豆資源收集、研究和育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用72份木豆種質(zhì)資源以國內(nèi)資源為主，均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究室收集(表1)。所有供試種質(zhì)資源均種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草基地，每份材料種植10株，株間距1 m，行間距1 m，常規(guī)大田管理。

表1 供試木豆種質(zhì)資源信息

1.2 DNA提取

在播種后田間生長40 d左右，采集木豆新鮮幼嫩葉片置于液氮中，保存在-80℃超低溫冰箱備用。參考周曉紅等[19]的方法，采用DNA提取試劑盒(OMEGA公司)提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品純度及質(zhì)量，利用核酸蛋白含量測定儀測定DNA樣品濃度，并將其用無菌水稀釋到50 ng·μL-1保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR引物來源和PCR擴(kuò)增體系

從Bohra等[20]開發(fā)的木豆SSR標(biāo)記中選取96對交由金斯瑞生物科技公司合成。選取形態(tài)差異較大的YD3，YD4，YN11，JX1，GD1和GX1 6份木豆種質(zhì)材料對96對SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選，篩選出多態(tài)性好、條帶清晰、主帶明顯的引物對72份供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增及遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。

PCR擴(kuò)增體系采用20 μL反應(yīng)體系，包括2×Es Taq MasterMix(Dye)10.0 μL，1.0 μL正向引物(10 μmol·L-1)，1.0 μL反向引物(10 μmol·L-1)，2.0 μL模板DNA(50 ng·μL-1)，剩余體積用ddH2O補(bǔ)足，PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)38次；最后72℃延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)保存圖片。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以DL2000 DNA marker作為參考對擴(kuò)增產(chǎn)物大小進(jìn)行讀數(shù)，對清晰且明顯的條帶建立數(shù)據(jù)庫，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。所記錄的原始數(shù)據(jù)利用Excel軟件形成二進(jìn)制矩陣，用于條帶多態(tài)性比較和聚類分析。利用NTSYS-ps2.10e軟件分析木豆種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity，GS)，然后利用GS值采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)對供試材料進(jìn)行聚類分析[21]。利用POPGENE1.32軟件計(jì)算SSR標(biāo)記等位基因數(shù)(Number of alleles，Na)、等位基因頻率、觀察雜合度(Observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(Excepted heterozygosity，He)和Shannon多態(tài)性指數(shù)(Shannon index,I)等遺傳多樣性參數(shù)[22]。參考Botstein等[23]方法，根據(jù)等位基因頻率計(jì)算每個(gè)SSR標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(Polymorphic information content，PIC)?；赟SR數(shù)據(jù)利用Sturcture 2.3.4軟件[24]確定K值，并進(jìn)一步計(jì)算每份木豆種質(zhì)資源相應(yīng)的Q值(歸入某一類群的概率)，對木豆種質(zhì)資源進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，確定各種質(zhì)資源的遺傳組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 木豆種質(zhì)資源間SSR擴(kuò)增特點(diǎn)

選取形態(tài)差異較大的YD3，YD4，YN11，JX1，GD1和GX1 6份木豆種質(zhì)資源對合成的96對SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選，共篩選出42對在6份木豆種質(zhì)資源中多態(tài)性好、條帶清晰、主帶明顯的SSR標(biāo)記，其他標(biāo)記中9對引物擴(kuò)增條帶不夠清晰；7對引物擴(kuò)增的主帶不夠明顯；38對引物擴(kuò)增結(jié)果沒有多態(tài)性。

利用篩選出的42對SSR標(biāo)記對72份木豆種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增及基因型分析發(fā)現(xiàn)，42對SSR標(biāo)記在72份木豆種質(zhì)中共檢測到118個(gè)等位基因，每個(gè)標(biāo)記2～5個(gè)等位基因，平均2.8個(gè)(表2)。42對SSR標(biāo)記的觀察雜合度的變化范圍為0.028～0.958，平均值為0.354；而期望雜合度的變化范圍為0.041～0.751，平均值為0.517，CcGM14962標(biāo)記的觀察雜合度最高，CcGM14613預(yù)期雜合度最高。42對SSR標(biāo)記的Shannon多樣性指數(shù)變化范圍為0.101～1.469，其平均值為0.844。多態(tài)信息含量值和Shannon多樣性指數(shù)都是CcGM14613最大，CcGM23321最小，表明CcGM14619具有較高的多態(tài)性檢測效率。

表2 42對SSR引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1遺傳相似系數(shù)分析 基于42對SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用NTSYS-pc 2.10e軟件對72份木豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，供試材料間的遺傳相似系數(shù)介于0.440～0.915之間，平均值為0.643。其中YN1和YN2，HN7和YD7，GX15和HN14的遺傳相似系數(shù)最大(0.915)。而YN21與HN2遺傳相似系數(shù)最小(0.440)。不同材料之間的遺傳相似系數(shù)值大多分布在0.600～0.700之間，這部分比例占54.15%，相似系數(shù)小于0.500的占2.39%(圖1)。

圖1 72份木豆種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)

2.2.2聚類分析 根據(jù)不同種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)和UPGMA法對72份木豆種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析(圖2)。在相似系數(shù)為0.566處將72份木豆種質(zhì)分為3大類群：其中，第Ⅰ類包括69份種質(zhì)材料，第Ⅱ類和第III類均為海南種質(zhì)資源，分別包括2份種質(zhì)(HN1和HN2)和1份種質(zhì)(HN18)。相似系數(shù)在0.65處可將第I類分為6個(gè)亞類，其中第1亞類包含12份種質(zhì)，云南4份、印度3份、廣西3份、廣東和海南各1份；第2亞類包含10份種質(zhì)，云南6份、廣西2份、廣東和緬甸各1份；第3亞類包含21份種質(zhì)，廣西6份、云南5份、海南5份、廣東、江西、緬甸、剛果和薩爾瓦多各1份；第4亞類包含12份種質(zhì)資源，云南6份、廣西2份、安徽、廣東、海南和印度各1份；第5亞類包含10份種質(zhì)，海南5份、廣西2份、廣東、云南和薩爾瓦多各1份；第6亞類包含4份國內(nèi)種質(zhì)，海南3份和廣東1份。

圖2 72份木豆種質(zhì)資源的聚類分析

2.3 木豆種質(zhì)資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步明確供試資源的遺傳組成，根據(jù)SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，使用Sturcture 2.3.4軟件對72份木豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。參照Evanno等[25]的方法，繪制ΔK隨K值增大的變化曲線，由圖所示，K=3時(shí)，ΔK值最大，即將72份木豆種質(zhì)資源劃分為3個(gè)類群(圖3)。本研究參考劉麗華等[26]的研究，將Q≥0.600視為遺傳背景相對比較單一，Q<0.600視為具有混合來源。分析各木豆材料在不同類群中的Q值發(fā)現(xiàn)，72份木豆種質(zhì)資源中57份種質(zhì)的Q值≥0.600，遺傳背景比較單一，有15份木豆種質(zhì)的Q值<0.600，遺傳背景較為復(fù)雜。在S1類群中包含26份木豆種質(zhì)，各種質(zhì)的Q值在0.413～0.984之間，22，23，24和36號種質(zhì)的Q值在0.6以下，具有混合來源，其遺傳背景比較復(fù)雜，其中22，23和24號種質(zhì)含有較多的S2背景；在S2類群中包含21份木豆種質(zhì)，各種質(zhì)的Q值在0.505～0.989之間，37，38，41，42和72號種質(zhì)的Q值在0.6以下；在S3類群中包含25份木豆種質(zhì)，各種質(zhì)的Q值在0.480～0.991之間，其中6份種質(zhì)的Q值在0.6以下，遺傳背景復(fù)雜(圖4、表3)。

圖3 K值曲線圖

圖4 基于SSR標(biāo)記的72份木豆種質(zhì)資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)(K=3)

表3 72份木豆材料的群體結(jié)構(gòu)

3 討論與結(jié)論

SSR標(biāo)記是研究作物種質(zhì)資源遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析的重要工具[27]。本研究利用42對SSR標(biāo)記對72份木豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，平均每個(gè)SSR標(biāo)記可檢測到2.8個(gè)等位基因，平均PIC值為0.442。這與Bohra等[20]和Odeny等[28]研究結(jié)果一致，但每個(gè)標(biāo)記可檢測的等位基因數(shù)和PIC值均顯著低于Dutta等[29]研究結(jié)果，而顯著高于Sarkar等[30]的研究結(jié)果，這可能是由于不同研究中所選用的SSR標(biāo)記和木豆種質(zhì)不同引起的。本研究利用42對SSR標(biāo)記分析供試木豆種質(zhì)資源間的平均遺傳相似系數(shù)為0.643，并將72份木豆資源分為3類，說明木豆種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，本文選用的42對SSR標(biāo)記能夠有效揭示不同木豆資源間的遺傳差異。Njung′e等[31]利用48對SSR標(biāo)記將79份‘馬拉維木豆’資源分成4個(gè)類群；Bohra等[20]利用217對多態(tài)性SSR標(biāo)記通過聚類和群體結(jié)構(gòu)分析，將94份木豆資源分成2個(gè)類群。說明SSR分析結(jié)果能夠很好地反映木豆種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系并對其群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效劃分，但遺傳多樣性和聚類分析結(jié)果與標(biāo)記的數(shù)量及供試材料的數(shù)量、來源及親緣關(guān)系都有關(guān)系[32]。

聚類分析與群體結(jié)構(gòu)分析是探究作物種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳背景的有效手段，是作物種質(zhì)資源保護(hù)和利用的前提[6]。本研究利用42對SSR標(biāo)記對72份不同來源的木豆種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，72份木豆資源被分為3個(gè)大類，其中第I類可分為6個(gè)亞類，多數(shù)不同來源地的資源并沒有聚在一個(gè)大類或亞類中，如來自海南的18份木豆資源除了第I類的第2亞類外在其他類群中均有分布，說明本研究供試材料的聚類結(jié)果和地理來源并不完全一致，這與高桂娟和李志丹[33]對45份木豆種質(zhì)資源的形態(tài)多樣性分析結(jié)果一致。在王秀芹和王洪剛[34]、李衛(wèi)華等[35]對小麥種質(zhì)資源及陳斐等[36]對苜蓿(Medicagosativalinn)種質(zhì)資源的研究也發(fā)現(xiàn)種質(zhì)資源的地理來源對遺傳差異有一定影響，但兩者并不存在必然聯(lián)系。這可能與現(xiàn)代不同地區(qū)種質(zhì)資源交流頻繁及供試資源中許多為非野生資源有關(guān)。群體結(jié)構(gòu)分析表明20.83%的木豆種質(zhì)資源擁有混合來源(Q<0.6),遺傳背景復(fù)雜，從分子水平說明不同類群的木豆資源間存在較頻繁的基因交流，這可能與木豆常異花授粉特性有關(guān)[37]。

本研究利用42對多態(tài)性SSR引物對72份木豆種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析。42對SSR引物在72份木豆種質(zhì)資源中共檢測到等位基因118個(gè)。根據(jù)聚類分析將72份木豆資源分為3個(gè)大類，聚類結(jié)果和地理來源并不完全一致。群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)79.17%的木豆種質(zhì)資源遺傳背景比較單一，20.83%的資源擁有復(fù)雜的遺傳背景。本研究結(jié)果，不僅為育種者在利用這些育種材料時(shí)提供了有效的親緣關(guān)系信息，還提供了種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度，為木豆雜交育種中雜交親本的選擇提供了重要參考。