張霞,雷學俊,劉芳,劉多濤,羅青春,施思,喬宗偉,鄭佳

(宜賓五糧液股份有限公司技術研究中心,四川 宜賓,644007)

濃香型白酒釀造過程中微生物的來源十分廣泛,如窖泥、曲藥和釀造區(qū)域空氣中的微生物[1],研究表明釀造周圍環(huán)境微生物對傳統(tǒng)白酒釀造真菌的貢獻率可達20%～39%[2-3]。酵母菌是濃香型白酒中產(chǎn)生乙醇和其他香氣成分的功能微生物,曲藥自身的酵母菌和窖房環(huán)境中彌漫的酵母菌是糟醅發(fā)酵過程中的主要菌源,然而環(huán)境空氣中酵母菌的類別和量比關系與當?shù)氐淖匀画h(huán)境條件息息相關,因此,有必要對釀酒周圍環(huán)境中的酵母菌進行系統(tǒng)研究。

目前,白酒釀造領域對酵母菌的研究主要集中在對曲藥、糟醅和窖泥中酵母菌群落結構的分析以及可培養(yǎng)酵母分離篩選,以及發(fā)酵特性方面的研究[4-7],部分涉及已分離酵母菌的風味[8-12]。楊建剛等[13]從瀘州老窖酒不同發(fā)酵階段酒醅中共分離到130株酵母菌,其中126株被鑒定為15個不同的種,并討論了酵母種對部分風味特征形成的影響；明紅梅等[14]從不同發(fā)酵時期的濃香型大曲中分離到6株酵母,并檢測其中1株異常威克漢姆酵母發(fā)酵液中的揮發(fā)性成分,發(fā)現(xiàn)對濃香型大曲貢獻的關鍵香味成分為愈創(chuàng)木酚、苯乙醇、吡嗪類等；杜剛等[15]從酒曲中分離純化出10株酵母菌用于果酒發(fā)酵；譚壹等[16]利用7種不同的培養(yǎng)基從五糧液發(fā)酵中期糟醅獲得57株酵母菌,經(jīng)鑒定分別屬于Saccharomycescerevisiae、Pichiakudriavzevii、Candidarugosa和Candidaglabrata這4個不同的種；竇曉等[17]在不同發(fā)酵時期的大曲中分離得到260株酵母菌,結果鑒定為22個種,主要為Pichiacaribbica,W.anomalus,S.fibuligera,C.orthopsilosis,Meyerozymaguilliermondii,S.cerevisiae,Cryptococcusneoformansvar.grubii,Clavisporalusitaniae等。但是涉及濃香型白酒釀造周圍環(huán)境空氣中酵母菌種類及其風味物質(zhì)的研究鮮有報道。

本研究通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對五糧液車間空氣中酵母菌進行分離、純化,對篩選到的酵母進行鑒定,研究其生物學特性和風味物質(zhì)組成,為濃香型白酒酵母菌種資源的完善提供有力的菌種資源和數(shù)據(jù)支撐,為其在濃香型白酒生產(chǎn)中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

所有酵母菌株均由宜賓五糧液股份有限公司技術研究中心實驗室保藏,分離自五糧液釀造環(huán)境中。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離篩選：YEPD瓊脂培養(yǎng)基中加入0.2%的脫氧膽酸鈉和0.2%的氯霉素。

發(fā)酵：麥芽汁培養(yǎng)基,青島海博生物技術有限公司。

1.2 試劑和儀器

YEPD瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基,青島海博生物技術有限公司；脫氧膽酸鈉,北京奧博星生物技術有限責任公司；氯霉素,廣州賽國生物科技有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司；API 20 ACUX鑒定試劑盒,生物梅里埃公司；FKC-1型浮游菌采樣器,浙江蘇凈凈化設備有限公司；離心機,Eppendorf公司；顯微鏡,日本Olympus公司；生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技儀器有限公司；乙醇(HPLC,純度為99.8%),美國Honeywell公司；4-辛醇(GC純),美國Sigma-Aldrich公司。

毛細管色譜柱TG-WAX(30.0 m×0.25 mm,0.25 μm),美國Thermo公司；固相微萃取手柄和50 μm CAR/DVB/PDMS纖維萃取頭,美國Supelco公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)和液相色譜儀,美國Agilent公司；PAL RTC2多功能樣品前處理平臺(帶有SPME模塊),瑞士CTC公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的采集

在五糧液釀酒車間和制曲車間外圍環(huán)境采集空氣樣品,采用FKC-1型浮游菌采樣器,距離地面80 cm,將直徑為9 cm的麥芽汁瓊脂平板置于采樣器內(nèi),每次采樣設置3個平行,空氣流量為100 L/min,采樣時間為1 min。

1.3.2 菌株的分離

將采集樣品后的平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d,待菌落長出后,挑選菌落形態(tài)不同的疑似酵母單菌落于YEPD瓊脂培養(yǎng)基中,編號并劃線純化,重復純化2～3次,直至平板上的菌落都為同一形態(tài),利用傳代培養(yǎng)法,在4 ℃下進行斜面保存并編號。

1.3.3 菌株的鑒定

1.3.3.1 菌株形態(tài)學鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》進行[18]。

菌落形態(tài)觀察：將純化后的菌株接種于YEPD平板,置于28 ℃培養(yǎng)2～3 d,觀察單菌落,并記錄菌落的大小、形狀、顏色、透明度、質(zhì)地、邊緣、濕潤程度等菌落特征。

顯微鏡觀察細胞形態(tài)：挑取單菌落于5 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中,于28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,顯微鏡下觀察細胞的微觀特征。

1.3.3.2 菌株生理生化鑒定

按照梅里埃酵母菌生理生化鑒定試劑盒說明(API 20A CUX)測定菌株的生理生化特征。假菌絲觀察：將酵母接種于玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察酵母是否含有假菌絲。

1.3.3.3 菌株分子鑒定

基因組DNA提?。簩⒒罨木杲尤?0 mL麥芽汁培養(yǎng)基中,160 r/min、28 ℃搖瓶培養(yǎng)24 h后,室溫下12 000 r/min離心5 min獲得菌體,用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株的基因組DNA。

PCR擴增：采用酵母菌通用引物為NL1(5′-GCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′),PCR反應體系包括(μL)：基因組DNA 0.5、10×Buffer(含Mg2+)2.5、dNTP 1、聚合酶0.2、引物0.5、模板0.5,加雙蒸水至25；PCR循環(huán)條件為94 ℃ 4 min預變性、94 ℃ 45 s變性、55 ℃ 45 s退火、72 ℃ 1 min延伸、循環(huán)30次,72 ℃ 10 min修復延伸,4 ℃終止反應。經(jīng)PCR反應擴增出26S rDNA產(chǎn)物,用PCR及酶反應產(chǎn)物純化試劑盒將PCR產(chǎn)物進行純化,將純化產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司完成測序。

1.3.4 酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

參考文獻[19]所述方法將菌株26S rDNA D1/D2序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，選取相似度較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列作為參比對象；利用MEGA 5.0軟件進行多序列比對、Kimura-2模型計算進化距離、最后采用鄰接法(neighbor-joining)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，其中進化樹拓撲分析為1 000次。

1.3.5 揮發(fā)性風味成分的測定

使用HS-SPME-GC-MS檢測菌株發(fā)酵體系中揮發(fā)性風味成分[19]。吸取2 mL發(fā)酵液于20 mL頂空樣品瓶中,加入內(nèi)標(4-辛醇,終質(zhì)量濃度0.5 mg/L),60 ℃平衡15 min,插入萃取頭吸附45 min后,插入GC進樣口熱解析3 min。

色譜和質(zhì)譜條件：進樣口溫度為230 ℃,載氣(He)流速為1 mL/min,采用不分流模式進樣；氣相色譜升溫程序：起始溫度40 ℃,保持5 min,以4 ℃/min升至230 ℃,保持15 min。質(zhì)譜EI源,電子轟擊能量70 eV；離子源溫度200 ℃,四級桿溫度150 ℃,質(zhì)數(shù)掃描范圍35～350 amu。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用R語言軟件[20]進行揮發(fā)性風味物質(zhì)熱圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

從五糧液釀酒車間和制曲車間外圍環(huán)境采集空氣樣品,從中共分離到酵母菌株73株,分屬于11個屬,14個種(表1)。

表1 酵母菌的分離結果Table 1 Yeasts isolated from workshop

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

14株不同種酵母菌菌落和顯微鏡形態(tài)結構如圖1所示：此14株菌菌落均為不透明,其中Y1、Y2、Y5、Y7、Y8和Y9的菌落形態(tài)相似,均為表面光滑濕潤,邊緣整齊無擴散,易挑取,區(qū)別在于菌落顏色有一定差異；Y4和Y6的菌落形態(tài)相似,都是表面干燥不光滑,邊緣不整齊無擴散,易挑??；而Y3則為乳白色,表面干燥不光滑,菌落分2圈,里圈光滑,外圈有顆粒狀,邊緣整齊擴散,易挑取。

圖1 代表性酵母菌的菌落和微觀結構Fig.1 The colony morphologies and micromorphologies of representative yeasts 注：A～N分別為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、 Y11、Y12、Y13、Y14的菌落形態(tài)；a～n為Y1、Y2、Y3、Y4、 Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14的顯微形態(tài)

微觀形態(tài)方面,此14株菌細胞大都為橢圓形(Y7為圓形),多核(Y9單核),單生,芽殖,但細胞大小不一。其中Y4藕節(jié)狀,裂殖或芽殖,Y6為藕節(jié)狀,無核。

2.2.2 生理生化特征

利用API 20A CUX生理生化鑒定試劑盒測定菌株的生理生化特征(表2),不同種的酵母菌株在碳氮源的利用上不完全相同。Y1、Y2、Y3、Y4、Y7、Y8、Y10、Y13等8株菌在碳氮源利用方面符合酵母菌的特征與鑒定手冊[18]。

表2 代表性酵母菌的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical tests of representative yeasts

所有的酵母菌均能利用葡萄糖(表2),淀粉是濃香型白酒糟醅中主要的碳源物質(zhì),由此可見本研究中從車間空氣中篩選的酵母菌株均具備代謝葡萄糖的能力。另外,Y6的碳源利用結果和酵母菌的特征與鑒定手冊中相差較大,Y6可額外利用半乳糖、蔗糖、麥芽糖和α-甲基-D-葡萄糖苷,Y11可額外利用麥芽糖、松三糖、木糖和α-甲基-D-葡萄糖苷,具體原因仍需進一步探討。假菌絲方面,Y4、Y6、Y9和Y14有假菌絲出現(xiàn),其他10株菌都沒有發(fā)現(xiàn)假菌絲。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

核糖體DNA中的26S rDNA D1/D2區(qū)具有較高的突變率,可作為親緣關系較近的菌株之間的分類研究[21]。此14株不同種的酵母菌株的26S rDNA D1/D2序列和用BLAST檢索到的與之有高度同源性菌株的26S rDNA D1/D2序列通過MEGA5.0軟件進行比對和構建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),可通過系統(tǒng)發(fā)育樹的建立對此14株不同種的酵母菌種間親緣關系進行了直觀界定。

圖2 代表性菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of representative strains 注：采用鄰接法對豐度大于1%的菌株序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹；分支點 的數(shù)字為分子的Bootstrap值,標尺表示核酸距離,分支長度為相似度

由圖2可知,Y1和Wickerhamiellapararugosa聚為一支、Y2和Pichiakudriavzevii聚為一支、Y3和Pichiaexigua聚為一支、Y4和Candidaethanolica聚為一支、Y5和Kazachstaniabulderi聚為一支、Y6和Saccharomycesunisporus聚為一支、Y7和Saccharomycescerevisiae聚為一支、Y8和Naumovozymacastellii聚為一支、Y9和Meyerozymacaribbica聚為一支、Y10和Debaryomyceshansenii聚為一支、Y11和Zygosaccharomycesbailii聚為一支、Y12和Clavisporalusitaniae聚為一支、Y13和Debaryomycessubglobosus聚為一支、Y14和Saccharomycopsisfibuligera聚為一支。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以直觀地看出該14株酵母菌都已經(jīng)鑒定到種。

2.4 菌株發(fā)酵揮發(fā)性風味物質(zhì)

酵母在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生一些次級代謝產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物,如高級醇類、酸類、酯類、萜烯類、酚類、吡嗪類等,這些物質(zhì)對白酒的風味具有重要的貢獻。因此,使用HS-SPME/GC-MS測定此14株不同種酵母菌發(fā)酵液中的揮發(fā)性風味物質(zhì)。

2.4.1 風味物質(zhì)總含量

五糧液釀造環(huán)境中產(chǎn)酒酵母相對豐富一些,醇類物質(zhì)主要在酵母繁殖過程中形成,產(chǎn)酒酵母合成高級醇的能力比較強,而酸和醇發(fā)生酯化反應又會產(chǎn)生酯類物質(zhì),酯類是芳香化合物,在濃香型白酒中起著重要作用,是形成酒體香氣濃郁的主要因素。如圖3所示,酵母菌發(fā)酵液風味物質(zhì)中,總酯和總醇含量相對較高。其中,Y1、Y2、Y5酯類總含量比較高,含量都在60 mg/L以上,Y1最高達到95 mg/L；Y1、Y5、Y7、Y8、Y10醇類總含量比較高,都在60 mg/L以上,Y7(S.cerevisiae)則高達115 mg/L。

圖3 酵母菌風味物質(zhì)總含量Fig.3 Total content of flavor compounds in yeasts

酸類影響白酒的口感和后味,是影響白酒口味的主要因素,酵母菌發(fā)酵液中酸類成分總含量相對較低,可能是因為酵母本身產(chǎn)酸能力較弱,加上酸和醇又發(fā)生酯化反應生成了酯類物質(zhì),使得發(fā)酵液中總酸含量偏低,總含量最高的是Y11(15.12 mg/L),其次是Y1(8.9 mg/L)；發(fā)酵液中醛酮類含量極低,Y5醛類總含量最高,僅7 mg/L。

2.4.2 風味物質(zhì)

白酒中酯的形成主要是由微生物細胞中所含酯酶的催化作用而產(chǎn)生的,酵母對乙酯的合成能力最強[10]。如圖4-a所示,發(fā)酵液中酯類物質(zhì)主要是乙酯,己酸乙酯是濃香型白酒的主體香成分,王濤等[22]發(fā)現(xiàn)濃香型白酒釀造環(huán)境中存在大量能夠促進糟醅產(chǎn)已酸乙酯的酵母,本文中W.pararugosa(Y1)、K.bulderi(Y5)和Z.bailii(Y11)都可產(chǎn)生己酸乙酯,對于此3株菌能否促進糟醅產(chǎn)生更多的己酸乙酯還需進一步研究；發(fā)酵液中檢測出的乙酸乙酯含量也比較高,Y1、Y2、Y5中乙酸乙酯含量相對較高,Y1最高達到了70 mg/L。醇類除乙醇外,含量比較高的有苯乙醇、異戊醇和異丁醇,對形成酒的風味和促使酒體豐滿、濃厚起著重要的作用,Y7和Y10主要產(chǎn)苯乙醇,還有一定量的異戊醇。Y2、Y5、Y11棕櫚酸乙酯含量較高,高沸點酯在白酒中有一定的含量范圍時能夠穩(wěn)定酒體的香氣。酸類主要是己酸、乙酸和乳酸等有機酸類,影響白酒的口感和后味,其中Y1發(fā)酵液己酸含量較高,Y11發(fā)酵液乙酸含量較高,乳酸不具揮發(fā)性,故未檢出；醛類物質(zhì)中含量相對較高的是苯甲醛和苯乙醛,但相比其他主體風味物質(zhì)這2種醛類在發(fā)酵液中含量均比較低。

圖4 酵母菌風味物質(zhì)含量Fig.4 Content of flavor compounds in yeasts

此14株酵母菌能產(chǎn)生多種風味物質(zhì),除正常主體風味外,還會產(chǎn)生其他多種微量成分,多以水果香味為主。如圖4-b所示,發(fā)酵液中微量風味物質(zhì)主要有庚酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸丁酯、十二酸乙酯、戊酸乙酯、壬酸乙酯、十四酸乙酯、苯酚、乙偶姻和吡嗪類等。Y1、Y5、Y7、Y8、Y10、Y11、Y14發(fā)酵液微量風味物質(zhì)非常豐富；SUSANNE[23]分離的1株C.pararugosa在15 ℃下溫育的葡萄酒中存在較低濃度的揮發(fā)性酚,其他有關W.pararugosa產(chǎn)酚類物質(zhì)的報道幾乎沒有,對S.cerevisiae的報道以產(chǎn)醇酯類物質(zhì)居多[24],而本文中W.pararugosa(Y1)和S.cerevisiae(Y7)發(fā)酵液中除了有酯類和醇類物質(zhì)外,苯酚含量較高,分別為2 260和2 427 μg/L,酚類化合物是白酒中重要的呈香呈味物質(zhì)和有益成分[25],因此有必要對這2株菌所產(chǎn)風味物質(zhì)進行深入研究。乙偶姻是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中重要香氣成分四甲基吡嗪生物合成的前體物質(zhì),是多種微生物糖代謝的中間產(chǎn)物[26-27],具有特殊奶油香氣,是白酒微量風味的重要組成成分。K.bulderi(Y5)發(fā)酵液中風味物質(zhì)較豐富,除主體風味醇酯外,還檢測出了乙偶姻,達到1 568 μg/L。Y3和Y12發(fā)酵液中風味成分基本一致,都檢測出較高的異戊酸,異戊酸是生成異戊酯類的前體物質(zhì),參與白酒的風味組成；吡嗪具有明顯的焦香或烤堅果香味,是白酒中含氮微量成分,同時也是白酒香氣成分的重要組成物質(zhì)[28]。本研究中檢測到的吡嗪類物質(zhì)有6種,分別是：2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪,除菌株Y4,其他13株酵母菌發(fā)酵液中都檢測出此6種吡嗪類物質(zhì),且Y1這6種物質(zhì)含量較高。

綜上可見,酵母菌產(chǎn)生的風味物質(zhì)差異較大,可能是由于這些酵母菌之間生理生化差異明顯,因而導致最終產(chǎn)物不同,其中Y1、Y5、Y7和Y11這4株菌產(chǎn)風味物質(zhì)較豐富且含量較高,表明這4株酵母菌在濃香型白酒中具有更好的應用潛力,可以作為后續(xù)重點研究菌株。

3 結論

本研究利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從五糧液釀造車間空氣中分離篩選出73株酵母菌,它們分屬于11個屬14個種,其中,畢赤酵母屬Pichia最多,其次是德巴利酵母屬Debaryomyces,釀酒酵母屬Saccharomyces和復膜孢酵母屬Saccharomycopsis,表明白酒釀造糟醅和車間空氣中的酵母菌種屬的關聯(lián)度較大。進一步利用HS-SPME/GC-MS分析了酵母菌在麥芽汁培養(yǎng)基中的風味成分,結果表明酵母菌除了主要的乙酸乙酯、異戊醇、苯乙醇等常見風味物質(zhì)外,還會產(chǎn)生其他多種風味成分,如W.pararugosa、P.kudriavzevii和K.bulderi可產(chǎn)生乙酸乙酯,W.pararugosa、K.bulderi和Z.bailii可產(chǎn)生己酸乙酯,W.pararugosa和S.cerevisiae能產(chǎn)生苯酚,P.exigua和C.lusitaniae能產(chǎn)生異戊酸等。本研究中的酵母菌雖然代謝的風味物質(zhì)含量較低,但種類豐富,在發(fā)酵過程中對白酒風味的貢獻度以及代謝調(diào)控高產(chǎn)風味物質(zhì)性能優(yōu)化等還需進一步深入研究。