萬勇，鐘國豪，謝二磊

江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029

參茸補(bǔ)酒是由人參、白芍、甘草、當(dāng)歸、川芎、何首烏等15 味中藥組成的復(fù)方制劑，具有補(bǔ)益氣血功效，用于身體虛弱，氣血兩虧，腦力不足，精神疲倦等［1］。方中白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛等功效［2］，白芍中活性成分芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷具有保肝、抗炎、抗抑郁等方面的藥理作用［3-7］；甘草具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、調(diào)和諸藥等的功效［8］，其主要活性成分甘草苷和甘草酸具有抗病毒、抗腫瘤、抗抑郁等藥理作用［9-11］；何首烏的活性成分二苯乙烯苷具有抗炎、預(yù)防帕金森病和阿爾茨海默病等藥理作用［12-14］；阿魏酸作為當(dāng)歸和川芎共同的活性成分，具有抗血栓、降血脂等作用［15-16］。目前，對參茸補(bǔ)酒質(zhì)量研究僅為對阿魏酸或芍藥苷的測定［17］，較為簡單，為此，本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測定芍藥苷內(nèi)酯、二苯乙烯苷、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸6 個(gè)成分含量的高效液相色譜法（HPLC），為提高參茸補(bǔ)酒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫公司Agilent 1260II 型高效液相色譜儀；瑞士梅特勒-托利多公司XSE－205 電子天平（十萬分之一），ME204TE 電子天平（萬分之一）。

1.2 試劑與試藥

2,3,5,4′四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷，批號110844-201915，含量：90.7%）；芍藥苷（批號110736-201943，含量：95.1%）；阿魏酸（批號110773-201915，含量：99.4%）；甘草苷（批號111610-201607，含量：93.1%）；甘草酸銨（批號110731-201619，含量：93.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥苷內(nèi)酯（批號DST190912-071，含量：98.0%）購自樂美天醫(yī)藥科技有限公司。參茸補(bǔ)酒（批號200190901、200190902、200190903，江西金頂藥業(yè)有限公司，規(guī)格：100 mL）。乙腈（Sigma公司）為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inert Sustain Swift C18 色譜柱；進(jìn)樣量10 μL；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B）梯度洗脫（0～25 min，12%A；25～42 min，12%～37%A；42～65 min，37%A；65～66 min，37%～12%A；66～75 min，12%A）；柱 溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；0～25 min 在230 nm 檢測芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷，25～42 min 在310 nm 檢測阿魏酸、甘草苷、二苯乙烯苷，42～75 min 在250 nm 檢測甘草酸。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備精密稱取對照品芍藥苷內(nèi)酯16.78 mg、芍藥苷20.00 mg、阿魏酸10.28 mg、甘草苷19.95 mg、二苯乙烯苷19.68 mg、甘草酸銨20.10 mg（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7），置于50 mL 量瓶中，50%乙醇定容至刻度，搖勻，分別精密吸取10、20、2、7、4、10 mL，置于250 mL 量瓶中，50%乙醇定容至刻度，搖勻，即得（濃度分別 為13.156、30.432、1.645、10.401、5.731、14.651 μg/mL）。

2.2.2供試品溶液精密量取參茸補(bǔ)酒2 mL，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.2.3陰性對照溶液按照參茸補(bǔ)酒的處方，分別制備缺白芍、甘草、當(dāng)歸和川芎以及何首烏的陰性對照溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

吸取對照品、供試品、陰性對照溶液各10 μL；在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，色譜圖如圖1。分離度良好（R>1.5），且陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC色譜圖：A.對照品；B.供試品；C.缺白芍陰性樣品；D.缺當(dāng)歸、川芎陰性樣品；E.缺甘草陰性樣品；F.缺制何首烏陰性樣品

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的對照品溶液1、2、5、10、20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分析，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得到6 個(gè)成分的回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，結(jié)果芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、二苯乙烯苷、甘草酸峰面積RSD（n=6）分別為0.41%、0.09%、0.09%、0.33%、0.09%、0.11%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，于0、2、4、8、12、16、24 h 分別進(jìn)行測定，測得芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、二苯乙烯苷、甘草酸峰面積的RSD（n=7）分別為0.10%、0.23%、0.25%、0.17%、0.11%、0.43%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品（批號20190901）6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，測得芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、二苯乙烯苷、甘草酸平均含量（n=6）分別為0.38%、0.20%、0.54%、0.34%、0.34%、0.41%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已測得含量的同一批供試品（批號20190901）6 份，各1 mL，按100%水平精密加入“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 耐用性試驗(yàn)

考察了CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）；ACE Excel C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）；Inert Sustain Swift C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）色譜柱，結(jié)果3 根色譜柱色譜峰分離情況均無明顯差別，表明耐用性良好。

2.10 樣品含量測定

取不同批號的3 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（μg/mL，n=3）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

應(yīng)用DAD 檢測器在190～400 nm 波長對各成分進(jìn)行掃描。在230 nm 波長處芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷有最大吸收，在250 nm 波長處甘草酸有最大吸收，在310 nm 波長處阿魏酸、甘草苷、二苯乙烯苷均有較大吸收。該波長下，干擾少且穩(wěn)定，故同時(shí)選擇230、250、310 nm 作為檢測波長。

3.2 流動相的篩選

同時(shí)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸流動相3 個(gè)溶劑系統(tǒng)。結(jié)果顯示乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫時(shí)，各成分色譜峰峰形均較好，各成分與相鄰色譜峰分離度均大于2.0。最終，確定乙腈-0.1%磷酸作為流動相。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC 法同時(shí)測定參茸補(bǔ)酒中芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、二苯乙烯苷、甘草酸含量的方法，各色譜峰分離效果好，基線平穩(wěn)，重現(xiàn)性較好，且方法簡便。可為進(jìn)一步完善參茸補(bǔ)酒的質(zhì)量評價(jià)方法提供參考依據(jù)。