謝永麗，湯華

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，天津 300070）

肝細(xì)胞癌（HCC）是人類主要惡性腫瘤之一，死亡率排名全球第4位。而乙型肝炎病毒（HBV）感染是引發(fā)HCC的主要危險(xiǎn)因素，占全球HCC病例的一半以上。因此，迫切需要更好地了解HBV導(dǎo)致HCC的分子機(jī)制以及找到新型治療靶點(diǎn)。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中發(fā)生的最豐富的修飾。研究表明，m6A在病毒和疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。雖然YTHDF1（YTH N6-methyladenosine RNA-binding protein 1）已經(jīng)被報(bào)道與卵巢癌抗癌免疫療法[1]和海馬依賴性學(xué)習(xí)及記憶[2]等有關(guān)，但其在HBV相關(guān)肝癌中的作用研究尚少。

本研究通過分子克隆機(jī)制構(gòu)建了過表達(dá)和敲降YTHDF1質(zhì)粒，探討YTHDF1對(duì)HBV編碼蛋白表達(dá)的影響和對(duì)HBsAg、HBeAg抗原分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人正常肝細(xì)胞L02、肝癌細(xì)胞系Huh7、HepG2.2.15細(xì)胞，均購買自ATCC細(xì)胞庫，并為本實(shí)驗(yàn)室液氮保存。胎牛血清（FBS）、DMEM、MEM-α培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基均購自美國GIBCO BRL。Lipofectamine2000購自Invitrogen。所有抗體、cDNA均購自中國天津賽爾生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)L02細(xì)胞、Huh7細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素以及100 IU/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。HepG2.2.15細(xì)胞用含有15%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 IU/mL青霉素、2 mmol/L谷氨酰胺以及200 μg/mL G 418的MEM-α培養(yǎng)基培養(yǎng)。上述細(xì)胞均培養(yǎng)在含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 過表達(dá)YTHDF1質(zhì)粒的構(gòu)建 用YTHDF1 cDNA作為模板進(jìn)行PCR，PCR循環(huán)體系如下：預(yù)變性95℃4 min；變性94℃1 min，退火55℃30 s，延伸72℃2 min，進(jìn)行“變性-退火-延伸”循環(huán)33次；延伸72℃10 min?；厥沾笮〖s為1.67 kb的PCR產(chǎn)物。對(duì)pCD3/Flag-KBE質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和XhoⅠ,回收大小約為5.6kb和1.67 kb酶切產(chǎn)物。然后連接，鋪板，小提鑒定，酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和XhoⅠ，將條帶正確的質(zhì)粒送測(cè)序。

1.2.3 敲降YTHDF1質(zhì)粒的構(gòu)建 首先針對(duì)YTHDF1 mRNA設(shè)計(jì)合成編碼shRNA的DNA單鏈，引物序列如表1，然后將其在95℃條件下退火5 min,室溫條件下靜置2 h，和用BamHⅠ和HindⅢ酶切好的pSilencer2.1-U6 neo質(zhì)粒進(jìn)行連接，鋪板，小提鑒定（酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ和XhoⅠ）。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.4 轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體法）在Huh7細(xì)胞中，將HBV蛋白質(zhì)粒與pSilencer2.1-U6 neo、pshR-YTHDF1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染，每組兩個(gè)質(zhì)粒分別各轉(zhuǎn)0.5 μg，將質(zhì)粒和Lipofectamine2000按照1 μg：1 μL比例分別加入到無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫靜置5 min，然后將Lipofectamine2000管加入到質(zhì)粒管中，室溫靜置20 min，最后加入到細(xì)胞板中。轉(zhuǎn)染6 h換液，48 h收取蛋白樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 ELISA實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體法）在HepG2.2.15細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)、敲降YTHDF1及其對(duì)照質(zhì)粒。在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)、敲降YTHDF1及其對(duì)照質(zhì)粒的同時(shí)，共同過表達(dá)pHBV1.3質(zhì)粒，在L02細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)YTHDF1及其對(duì)照質(zhì)粒的同時(shí)，共同過表達(dá)pHBV1.3質(zhì)粒，每孔質(zhì)粒共1 μg。轉(zhuǎn)染方法同1.2.4。48、72 h分別收取600 μL上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Western印跡實(shí)驗(yàn) 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液收取蛋白樣品，加入5×loading buffer，100℃加熱5 min，然后冰置5 min。用10%SDS-PAGE膠分離蛋白（蛋白上樣量為30 μL），將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉2 h，裁剪PVDF膜，分別用相應(yīng)的抗體孵育過夜。用TBST漂洗孵育一抗的PVDF膜，加入相應(yīng)的二抗孵育2 h，再用TBST漂洗孵育二抗的PVDF膜，用Western LightningTM化學(xué)發(fā)光試劑作用2 min，然后進(jìn)入暗室中用感光膠片曝光，等膠片完全晾干，分析結(jié)果并拍照。

1.2.7 ELISA檢測(cè)分泌HBsAg和HBeAg的抗原 根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，使用Image J軟件、Graph Pad Prism6.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均表示±s，組間比較采用雙側(cè)Studentt檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western印跡檢測(cè)YTHDF1的表達(dá) 如圖1所示，與正常肝細(xì)胞L02相比，HBV陰性肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞和HBV陽性肝癌細(xì)胞HepG2.2.15細(xì)胞中YTHDF1的表達(dá)分別增加4倍和7倍，YTHDF1在HBV陽性肝癌細(xì)胞HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)是HBV陰性肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞的1.5倍（t=17.4、39.6、8.4，均P＜0.05）。

圖1 Western印跡檢測(cè)YTHDF1在不同細(xì)胞中的表達(dá)Fig 1 The expression of YTHDF1 in different cells detected by western blotting assay

2.2 YTHDF1過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用YTHDF1 cDNA作為模板，YTHDF1-295-BamHI、YTHDF1-1971-XhoI作為上下游進(jìn)行PCR，產(chǎn)生大小約為1.67 kb的條帶（圖2A）。對(duì)pCD3/Flag-KBE質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，產(chǎn)生大小為5.6 kb和1.67 kb的條帶（圖2B）。最后進(jìn)行酶切鑒定，挑選同時(shí)有5.6 kb和1.67 kb兩條條帶的2號(hào)質(zhì)粒送測(cè)序（圖2C）。將測(cè)序結(jié)果序列和NCBI序列比對(duì)。測(cè)序結(jié)果正確后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后第3天，制備細(xì)胞裂解物，用Flag抗體進(jìn)行檢測(cè)，確定了YTHDF1在細(xì)胞中表達(dá)（圖2D）。

圖2 pCD3/Flag-YTHDF1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig 2 Construction and validation ofplasmidpCD3/Flag-YTHDF1

2.3 YTHDF1敲降質(zhì)粒的構(gòu)建 將pSilencer2.1-U6 neo質(zhì)粒進(jìn)行酶切，產(chǎn)生大小為5.6 kb的條帶（圖3A），小提酶切鑒定挑選同時(shí)有大小為5.6 kb和0.37 kb兩條條帶的質(zhì)粒10號(hào)送測(cè)序（圖3B）。測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的引物比對(duì)，測(cè)序結(jié)果正確后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后第3天，制備細(xì)胞裂解物，用YTHDF1抗體進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證pshR-YTHDF1質(zhì)粒有效（圖3C）。

圖3 pshR-YTHDF1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig 3 Construction and identification of plasmid pshR-YTHDF1

2.4 敲降YTHDF1后HBV編碼蛋白的表達(dá)水平 首先驗(yàn)證了HBV編碼蛋白質(zhì)粒的有效性（圖4A），其次Western印跡檢測(cè)敲降YTHDF1后，HBV編碼蛋白表達(dá)水平的變化（圖4B）。結(jié)果顯示，敲降YTHDF1后，HBV基因組編碼HBc蛋白（t=9.5）、HBs蛋白（t=5.2）、preS1蛋白（t=25.7）、preS2蛋白（t=9.0）、HBx蛋白（t=19.7）、HBV DNA Pol蛋白（t=23.0）均降低（均P＜0.05）。

圖4 Western印跡檢測(cè)Huh7細(xì)胞中pshR-YTHDF1對(duì)HBV編碼蛋白的影響Fig 4 The effect of pshR-YTHDF1 on HBV-encoded proteins in Huh7 cell dctected by western blotting assay

2.5 ELISA檢測(cè)過表達(dá)和敲降YTHDF1對(duì)HBsAg和HBeAg抗原分泌的影響 與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pHBV1.3質(zhì)粒組分泌的HBeAg抗原在48 h（t=118.4）和72 h（t=28.7）分別增加8倍和6倍（圖5A），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。在Huh7細(xì)胞中，過表達(dá)YTHDF1時(shí)，HBsAg（t48h=5.5，t72h=5.0）和HBeAg抗原（t48h=5.7，t72h=6.3）表達(dá)水平增加，敲降YTHDF1時(shí)，HBsAg（t48h=16.0，t72h=7.9）和HBeAg抗原（t48h=9.0，t72h=14.3）表達(dá)水平降低（圖5B、C）。在HepG2.2.15細(xì)胞中，過表達(dá)YTHDF1時(shí)，HBsAg（t48h=5.3，t72h=27.4）和HBeAg抗原（t48h=29.0，t72h=6.6）表達(dá)水平增加，敲降YTHDF1時(shí)，HBsAg（t48h=22.3，t72h=7.0）和HBeAg抗原（t48h=8.1，t72h=6.6）表達(dá)水平降低（圖5D、E），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而在正常肝細(xì)胞L02中過表達(dá)YTHDF1時(shí)，HBsAg（t48h=4.0，t72h=2.0）、HBeAg（t48h=3.5，t72h=1.8）抗原表達(dá)水平?jīng)]有增加，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5F、G）。

圖5 ELISA檢測(cè)HBsAg和HBeAg抗原的分泌Fig 5 ELISA for the detection of HBsAg and HBeAg antigen secretion

3 討論

HCC已成為全世界普遍存在的公共衛(wèi)生問題。HBV是引起HCC的主要危險(xiǎn)因素。HBV的當(dāng)前治療方法包括干擾素和核苷酸類似物拉米夫定[3-4]、阿德福韋、恩替卡韋[5]、替比夫定、替諾福韋[6]以及最近獲得FDA批準(zhǔn)的替諾福韋阿拉芬酰胺。核苷酸類似物進(jìn)行抗HBV治療，可以有效抑制病毒的復(fù)制，但不能根除肝細(xì)胞核內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。然而，在不根除cccDNA的情況下，即使通過抗病毒治療實(shí)現(xiàn)了功能性治愈，HBV仍然繼續(xù)存在誘發(fā)肝癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，特別是對(duì)于已經(jīng)發(fā)展為肝硬化的患者[7]。治療性疫苗旨在通過引發(fā)新的抗病毒反應(yīng)來增強(qiáng)免疫力，這些疫苗可能無法誘導(dǎo)功能性治愈，因?yàn)樗鼈兊男ЯΣ蛔阋哉T導(dǎo)HBV特異性T細(xì)胞。由于目前缺乏有效的干預(yù)措施，所以對(duì)HCC發(fā)生的分子機(jī)制的了解至關(guān)重要。

m6A可以調(diào)節(jié)細(xì)胞RNA生物學(xué)的許多方面[8-9]，這主要取決于m6A讀碼器[10]。多項(xiàng)研究指出，肝細(xì)胞損傷可能是由HBV復(fù)制和病毒產(chǎn)物的積累引起的[11]。而且HCC的發(fā)生與m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)蛋白的異常表達(dá)有關(guān)[12-17]。此外，YTHDF1在調(diào)控HCC細(xì)胞的細(xì)胞周期和代謝方面也發(fā)揮著重要作用。因?yàn)橐延形墨I(xiàn)指出，YTHDF2和YTHDF3可以調(diào)節(jié)HBV的生命周期[18]，耗盡YTHDF2或YTHDF3會(huì)顯著增加HBs蛋白和HBc蛋白的表達(dá)。所以在這里筆者集中研究YTHDF1對(duì)HBV的影響，其中包括HBV編碼的蛋白水平和細(xì)胞分泌的抗原表達(dá)水平。

本研究中，筆者確定YTHDF1在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。然后構(gòu)建了過表達(dá)和敲降YTHDF1質(zhì)粒。HBV編碼的蛋白中HBc蛋白和HBs蛋白分別構(gòu)成病毒衣殼和包膜，HBV DNA Pol蛋白在體內(nèi)和體外都促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，HBx不構(gòu)成病毒體的一部分，起轉(zhuǎn)錄反式激活的作用。HBV病毒蛋白可以影響病毒和宿主基因的表達(dá)。所以筆者首先研究YTHDF1對(duì)HBV病毒蛋白的影響。敲降YTHDF1后，HBV基因組編碼的蛋白表達(dá)降低。HBsAg表明機(jī)體被病毒感染，HBeAg表明病毒的傳染性、病毒的復(fù)制和肝臟損害程度。當(dāng)HBsAg和HBeAg同時(shí)表達(dá)時(shí)表明感染嚴(yán)重。所以本實(shí)驗(yàn)證明YTHDF1促進(jìn)了HBsAg和HBeAg抗原的分泌。而在低表達(dá)的L02細(xì)胞中，過表達(dá)YTHDF1對(duì)HBsAg和HBeAg抗原的分泌沒有影響。

綜上所述，YTHDF1在肝癌細(xì)胞中可以促進(jìn)HBV編碼蛋白的表達(dá)和HBsAg、HBeAg抗原分泌，所以YTHDF1可能在HBV感染中起重要作用。由于其對(duì)HBV DNA Pol蛋白表達(dá)的影響最大，所以后續(xù)的研究可能是YTHDF1影響HBV DNA Pol蛋白表達(dá)的具體分子機(jī)制。本研究為闡明m6A修飾調(diào)節(jié)HBV編碼蛋白的表達(dá)提供新理論依據(jù)，也具有潛在的臨床應(yīng)用意義。