陳豫閩 劉俊英 賈國強(qiáng) 郭志玲

慢性腎衰竭(CRF)是所有慢性腎病的終末結(jié)局，但其致病機(jī)制尚不清楚，血清轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是最常見的致腎纖維化生長因子[1]，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)參與免疫及炎癥反應(yīng)[2]，低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α高表達(dá)會促進(jìn)纖維化因子表達(dá)[3]。有研究顯示，以上因子均與腎組織病變及腎臟疾病發(fā)展間存在密切聯(lián)系，其血清濃度在反映腎衰竭病情中具有一定價值。而飲食改變、長期服藥、腸道pH改變、腸道內(nèi)蛋白質(zhì)分解細(xì)菌數(shù)量增多等多種因素將造成CRF患者腸道菌群失衡[4]。本文主要研究血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平與CRF患者腸道菌群間的關(guān)系，探討腸道菌群失衡在CRF中的作用。

對象與方法

1.對象：納入2015年1月～2019年1月我院收治的111例CRF患者為CRF組，其中男61例，女50例，年齡22～65歲，平均年齡(44.89±16.58)歲，原發(fā)疾病分布：慢性腎小球腎炎63例，慢性間質(zhì)性腎炎33例，糖尿病腎病15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《內(nèi)科學(xué)》(第六版)中CRF的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)血清肌酐(SCr)高于正常上限值，心力衰竭、感染得到控制；(3)未使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑，且尚未進(jìn)行透析治療，估算的腎小球率過濾(eGFR)<50 ml·min-1·(1.73 m2)-1。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、肝臟、肺臟、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)疾病；(2)合并消化系統(tǒng)疾??；(3)合并惡性腫瘤、移植腎、孤立腎；(4)參與研究前6個月有手術(shù)史；(5)近期使用抗生素或益生菌等影響腸道菌群藥物。將同期于我院體檢的健康者50例作為對照組，其中男28例，女22例，年齡23～66歲，平均年齡(46.71±15.22)歲，兩組受試者性別及年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)一般資料和臨床資料收集：收集患者的一般資料(性別、年齡、原發(fā)疾病)及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)[血尿氮素(BUN)、SCr、血紅蛋白(Hb)]，采用EPI公式[5]計算eGFR。

(2)血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平檢測：采用生物素-親和素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ABC-ELISA)檢測血清TGF-β1水平，TGF-β1試劑盒由上海森雄科技實(shí)業(yè)公司提供。采用ELISA檢測血清MCP-1及HIF-1α水平，MCP-1 ELISA試劑盒購自上海源葉銳谷生物科技有限公司，HIF-1α ELISA試劑盒購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

(3)糞便采集及菌群分析：使用無菌采樣盒收集受試者糞便標(biāo)本，密封好后置入-80 ℃冰箱保存，使用德國Invitek Biotechonlogy and Biodesign公司生產(chǎn)的DNA提取檢測試劑盒進(jìn)行16S rRNA測序分析與菌群鑒定。菌群分析方法：使用16S rRNA V4～V6區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為V4F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)及V6R(5’-ACAGCCATGCNCACCT-3’)，共進(jìn)行25個循環(huán)，使用HiSeq第二代高通量測序平臺對PCR產(chǎn)物行雙端測序，測序完成后，使用Silva數(shù)據(jù)庫對樣本進(jìn)行物種對比與注釋，使用BugBase進(jìn)行表型預(yù)測。采用線性判別分析(LDA)分析菌種的差異。

結(jié) 果

1.兩組受試者實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較：CRF組患者BUN及SCr水平與對照組相比均顯著上升，eGFR及Hb水平均顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 兩組受試者實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較

2.兩組受試者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平比較：CRF組患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平與對照組相比均顯著上升(P<0.05)。見表2。

表2 兩組受試者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平比較

3.CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，CRF患者血清TGF-β1與SCr呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；血清MCP-1與BUN、SCr均呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；血清HIF-1α與BUN、SCr均呈正相關(guān)，與eGFR及Hb均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析

4.兩組受試者腸道菌群LDA值分布特征：兩組受試者腸道菌落差異分析見圖1。其中根據(jù)LDA分值可以看出，對照組中疣微菌科、柔嫩梭菌屬、雙歧桿菌與乳酸桿菌相對豐度高于CRF組，而CRF組中毛螺菌科、克雷伯菌屬、大腸埃希菌屬與腸桿菌科相對豐度高于對照組。

圖1 兩組受試者腸道菌群LDA值分布特征

5.CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α與不同菌群水平的相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α與毛螺菌科、大腸埃希菌屬及腸桿菌科水平均呈正相關(guān)，血清TGF-β1與克雷伯菌屬水平呈正相關(guān)，血清TGF-β1、MCP-1與疣微菌科水平均呈負(fù)相關(guān)，血清TGF-β1與雙歧桿菌及乳酸桿菌水平均呈負(fù)相關(guān)，血清HIF-1α與雙歧桿菌水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α與不同菌群水平的相關(guān)性分析

討 論

健康人的消化道內(nèi)定居了約100萬億微生物，其共同構(gòu)成了復(fù)雜而龐大的微生態(tài)系統(tǒng)。正常情況下，腸道菌群維持動態(tài)平衡，參與人體消化吸收、能量代謝、免疫反應(yīng)等生理活動，與人體相互適應(yīng)[6]。CRF是各種慢性腎臟病的終末結(jié)局，CRF患者腎臟出現(xiàn)腎小管萎縮、腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化等病理改變，該病同時損害腸道屏障，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡。

CRF導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡的具體機(jī)制尚未明確，但可能與CRF患者結(jié)腸排空時間延長、腸道蠕動減慢、消化能力下降、腸道內(nèi)可利用蛋白增多、患者血液尿素水平上升后其水解產(chǎn)生的氮水平增多導(dǎo)致腸腔糞便pH值改變、藥物使用等原因相關(guān)[7-8]。本文將111例CRF患者及50例健康者作為研究對象，分析兩組受試者腸道菌群特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRF患者腸道菌群發(fā)生了改變，對照組疣微菌科、柔嫩梭菌屬、雙歧桿菌及乳酸桿菌相對豐度高于CRF組，而CRF組患者毛螺菌科、克雷伯菌屬、大腸埃希菌屬及腸桿菌科相對豐度高于對照組，提示CRF患者腸道微生態(tài)失衡。腸道微生態(tài)失衡將產(chǎn)生多種不良影響，腸道菌群失調(diào)可引起菌群移位、毒素增多及局部及全身炎癥反應(yīng)，加速腎功能惡化進(jìn)展，增加患者不良預(yù)后風(fēng)險，其具體致病機(jī)制尚未清楚[9-10]。

相關(guān)研究表明，多種細(xì)胞因子均參與CRF患者腎臟病理改變，其中TGF-β1是公認(rèn)的致腎纖維化的重要生長因子，TGF-β1的過度堆積將導(dǎo)致腎組織細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，促進(jìn)腎組織纖維化[11-12]。腎組織病理改變還與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。MCP-1是一種對單核細(xì)胞具有趨化和激活活性的細(xì)胞因子，可特異性趨化單核細(xì)胞到組織，同時參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)，在MCP-1作用下，單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞聚集在內(nèi)膜下發(fā)生一系列免疫及炎癥反應(yīng)，正常狀況下，血清MCP-1水平較低[13]。腎小球硬化與毛細(xì)血管疏松是腎小管缺氧的常見原因，與此同時，腎小管缺氧也將引起間質(zhì)瘢痕的形成，導(dǎo)致腎小管萎縮，加速腎臟病變[14]。有研究結(jié)果表示，當(dāng)缺氧時，HIF-1α在腎臟上皮細(xì)胞上呈高表達(dá)，進(jìn)而增加促纖維化因子的表達(dá)，加速腎纖維化[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，CRF組患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平均顯著上升，且血清TGF-β1與SCr水平呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，血清MCP-1與BUN、SCr水平均呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，血清HIF-1α與BUN、SCr水平呈正相關(guān)，與eGFR及Hb水平呈負(fù)相關(guān)。提示腸道微生態(tài)失衡可能加重腎組織纖維化及炎癥反應(yīng)，參與CRF的發(fā)病機(jī)制。

分析CRF患者腸道菌群與血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，毛螺菌科、大腸癌細(xì)菌屬及腸桿菌科與CRF患者血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平均呈正相關(guān)，血清TGF-β1水平與克雷伯菌屬呈正相關(guān)，血清TGF-β1、MCP-1水平與疣微菌科均呈負(fù)相關(guān)，血清TGF-β1水平與雙歧桿菌及乳酸桿菌均呈負(fù)相關(guān)。CRF患者胃腸蠕動能力下降，消化能力減弱，消化道內(nèi)尿素水平上升，以上變化將引起具有酚類、脲酶形成酶的細(xì)菌家族得到擴(kuò)展，進(jìn)一步加重患者腸道菌群失衡及炎癥反應(yīng)。同時，克雷伯菌屬、大腸埃希菌屬還可通過將磷脂酰膽堿與左旋肉堿轉(zhuǎn)化為三甲胺，被肝黃素單加氧酶吸收，進(jìn)一步氧化為三甲胺-N-氧化物，加重患者炎癥反應(yīng)。以上研究結(jié)果均提示，CRF患者腸道菌群失衡將促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)，加重腎組織纖維化，參與CRF的進(jìn)程。

綜上所述，CRF患者腸道菌群失衡，其條件致病菌豐度較健康者增加，且與血清TGF-β1、MCP-1、HIF-1α水平相關(guān)，提示腸道菌群失衡可能加重炎癥反應(yīng)與腎纖維化，參與CRF的進(jìn)程。