常宇宸， 宋陸茜

（1.溫州醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，浙江 溫州325035；2.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院血液科，上海200233）

B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抑制劑首先被證明在淋系惡性腫瘤的治療價值而獲批用于治療淋系惡性腫瘤，但在髓系惡性腫瘤中的臨床應用進展卻相對滯后。直到2018年底，美國食品和藥品管理局先后審批通過了包括首個Bcl-2抑制劑藥物即venetoclax（VEN）在內的5種用于靶向治療髓系腫瘤小分子藥物。而隨后在更新版的臨床指南，如2019及后續(xù)版美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）指南隨即推薦將VEN應用于獲批適應證的治療，開啟了髓系腫瘤生物標志物驅動的治療策略新時代。本文就Bcl-2抑制劑在髓系腫瘤中的生物學機制進展及關鍵臨床研究作簡要綜述。

一、Bcl-2蛋白家族組成

Bcl-2基因最初命名于濾泡性淋巴瘤中典型的t（14；18）易位所致的與免疫球蛋白重鏈基因重排而功能未知的伙伴基因。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白過度表達時保護細胞免受凋亡間接促進增殖。Bcl-2蛋白是首個被發(fā)現(xiàn)與細胞凋亡相關的哺乳動物基因產(chǎn)物，對其功能的識別導致對細胞凋亡研究的激增，隨后認識到逃避細胞凋亡是癌癥的標志。避免細胞凋亡是許多血液惡性腫瘤的顯著特征。目前研究認識到Bcl-2一大家族相關的非酶蛋白，蛋白質間相互作用調節(jié)內在或線粒體凋亡途徑，一些成員對抗凋亡保護細胞，另一些則促進凋亡。依其結構和功能可分為3個亞家族：第一類是抗凋亡Bcl-2亞家族，含4個Bcl-2同源結構域（Bcl-2 homology,BH），即BH1～4，成員包括Bcl-2、Bcl-2-樣蛋白1（Bcl-2-like 1，Bcl-xL)、髓細胞白血病序列-1（myeloid cell leukemia sequence1,Mcl-1）、Bcl-2-樣2（Bcl-2-like 2，Bcl-w）和Bcl-2 A1；第二類是促凋亡效應蛋白，結構上與Bcl-2類似，含3個BH，即BH1～3，成員包括：Bcl-2相關蛋白X（Bcl-2-associated X,Bax）、Bcl-2拮抗劑/殺傷劑1（Bcl-2 antagonist/killer 1,Bak）和Bcl-2家族細胞凋亡調節(jié)劑BOK；第三類蛋白因僅含有BH3一個結構域又稱BH3結構域專一蛋白，根據(jù)其生理功能分為凋亡激活劑和凋亡敏化劑2個亞群，前者包含Bcl-2樣蛋白11（Bcl-2-like 11,BIM）和BH3相互作用域死亡激動劑（BH3 interacting domain death agonist，BID）[1]，凋亡敏化劑包含細胞死亡的Bcl-2相關激動劑（Bcl-2 associated agonist of cell death,BAD）、p53上調凋亡調節(jié)劑（p53-upregulated modulator of apoptosis，PUMA）、Bcl-2修 飾因子（Bcl-2 modifying factor，BMF）和Bcl-2相互殺傷劑（Bcl-2 interacting killing，BIK）。

二、靶向Bcl-2的細胞凋亡機制

抗凋亡蛋白亞家族成員的作用是抑制細胞凋亡起始，此過程是抗凋亡蛋白直接結合促凋亡效應蛋白Bax和Bak實現(xiàn)的，阻止后者游離激活，進而聚集在線粒體的外膜上，使細胞器線粒體外膜滲透性 （mitochondrial outer menbrane permeabilization,MOMP）改變和去極化產(chǎn)生孔隙，經(jīng)由孔釋放細胞色素C，激活胱天蛋白酶（caspase），破壞細胞發(fā)生細胞凋亡[2]。結構上Bcl-2蛋白家族的三類蛋白共享保守的BH3結構域，其中第三類蛋白僅含BH3結構域，并通過其特異結合到Bcl-2形成相應的疏水袋中，從而成為Bcl-2和其他抗凋亡蛋白亞家族成員的天然選擇性拮抗劑。上述各種激活劑、敏化劑通過不同的結構域與相應的Bcl-2抗凋亡蛋白亞家族成員選擇性地結合，拮抗前兩類蛋白的結合，繼而啟動凋亡過程或下調觸發(fā)凋亡的閾值[3]。

體內細胞綜合各種細胞外和細胞內信號，包括促進生存因素（如各種生長因子、營養(yǎng)物質）或促死亡因素（如致癌、DNA損傷、氧化應激等）后形成兩類蛋白的活性平衡，這種平衡決定細胞是存活還是凋亡。Bcl-2的異常表達使這種平衡傾向于保護惡性克隆免受凋亡而促進生存。Bcl-2作為最初從B細胞淋巴瘤發(fā)現(xiàn)的首個抗凋亡蛋白，靶向Bcl-2治療B細胞淋巴瘤尤其是慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤 （chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL）成為最早探索的適應證。CLL/SLL中因其單一藥物的顯著療效（復發(fā)CLL患者獲得75%～80%總反應率），以及后續(xù)與其他藥物聯(lián)合的更好的療效，先于AML獲得了美國食品和藥物管理局多次批準。Bcl-2抑制劑在髓系腫瘤的應用進展滯后可能是由于Bcl-2首先在淋巴細胞中被識別并命名，而相應的另一抗凋亡蛋白亞家族成員Mcl-1

Bcl-2蛋白家族成員及靶向Bcl-2的細胞凋亡機制

則在髓系中被識別而命名，由此產(chǎn)生了基于發(fā)現(xiàn)起源和蛋白質命名先入為主的假設，即淋系腫瘤的凋亡往往依賴Bcl-2，那么髓系惡性腫瘤凋亡則依賴Mcl-1，而不是Bcl-2。不過，近年來的基礎和臨床的探索證實，Bcl-2抑制劑在髓系腫瘤同樣有非常重要的價值。

藥物研發(fā)過程及應用機制的臨床前研究

Bcl-2蛋白BH3結構域及抗凋亡機制的早期研究推動了相關藥物的研發(fā)及臨床前研究。在血液腫瘤中，腫瘤細胞為應對微環(huán)境中的細胞應激壓力，通過遺傳學機制改變Bcl-2（或其他相關抗凋亡蛋白）表達或降低BH3結構域專一蛋白或凋亡效應蛋白。因此，靶向Bcl-2家族成員促使髓系細胞凋亡成為血液腫瘤研究熱點，推動后續(xù)抗髓系白血病藥物的研發(fā)。

一、Bcl-2反義寡核苷酸

前期研究通過敲除白血病小鼠模型中Bcl-2等位基因可獲得顯著的抗白血病療效反應，從而確定Bcl-2蛋白是維持白血病細胞存活的重要蛋白[4]。Bcl-2反義寡核苷酸是藥物研發(fā)的最早嘗試，但由于其表達的蛋白質產(chǎn)物半衰期長，干擾Bcl-2翻譯也不能快速降低Bcl-2蛋白水平，限制了其作為理想反義靶點的生物制劑[5]。因而，后續(xù)Bcl-2反義核苷酸（G3139）在AML和急性淋巴細胞白血病的臨床試驗中，因其使表達產(chǎn)物Bcl-2蛋白減少深度不足且一致性差，臨床療效反應差而最終研發(fā)失敗[6]。

二、三代BH3結構域寡肽化合物

隨后多項通過小分子化合物篩選研究成功模擬了Bcl-2蛋白多肽結構中BH3結構域的小分子寡肽物質，以取代天然BH3結構域，發(fā)揮拮抗劑作用。BH3結構域是Bcl-2家族蛋白多肽鏈上雙親合的α-螺旋，能結合于Bcl-2抗凋亡家族成員上所形成對應的疏水槽，負性調控Bcl-2家族的細胞保護活性[7]。

最初篩選出的幾種寡肽化合物抑制常數(shù)高（Ki＞100 nmol/L），相對親和力較弱導致相對較低的靶向活性并存在脫靶毒性的弊端，均未能獲得臨床成功[8]。后續(xù)研究者篩選鑒定出在Bcl-2的BH3結合槽中2個不同位點結合的化合物[9]，將這兩個部分通過化學鍵連接，形成親和力更大的復合物即ABT-737，ABT-737是首個被研發(fā)出的Bcl-2的高親和力抑制劑。開發(fā)出這種高親和力、蛋白-蛋白間相互作用抑制劑并能直接激活細胞凋亡，是藥物化學和細胞凋亡領域的一個里程碑。ABT-737與Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w都具有較高的親和力（Ki＜1 nmol/L），但與其他Bcl-2家族成員包括Mcl-1結合較弱（Ki＞460 nmol/L）[9]。臨床前研究表明，該藥雖具有較強誘導細胞包括原代腫瘤細胞凋亡的作用，但其較差的藥理學性質阻礙了其臨床發(fā)展。后續(xù)研發(fā)了一種口服生物可利用的ABT-737衍生物ABT-263——那維克拉（navitoclax，NAV），在早期臨床試驗中表現(xiàn)出對CLL/SLL和小細胞肺癌的活性[10]。然而，由于生理性血小板存活依賴于抗凋亡蛋白Bcl-xL，因而NAV易導致劑量限制的血小板減少癥。從而限制其在許多腫瘤尤其是髓系腫瘤中的進一步應用。這促使藥物研發(fā)者繼續(xù)開發(fā)了衍生物ABT-199，即目前的VEN，這是一種高度選擇性的BH3模擬小分子，對Bcl-2親和力更大（Ki＜1 nmol/L），但對Bcl-xL親和力低得多（Ki＞100 nmol/L），可有效阻斷Bcl-2蛋白的活性，降低骨髓原始細胞的凋亡閾值。白血病細胞系、患者原代細胞和小鼠原代異種移植物都對VEN非常敏感，死亡時間不到2 h，與在CLL/SLL中觀察到的體外敏感性一致[11]。

首個進入髓系白血病臨床應用的Bcl-2小分子抑制劑VEN，通過成功模擬BH3結構域而能特異性結合到Bcl-2抗凋亡蛋白相應的疏水袋，取代并釋放原先被結合阻隔的凋亡激活劑BIM和促凋亡效應蛋白Bax，前者直接與促凋亡效應蛋白，如Bax、Bak相互作用，導致這些蛋白在線粒體膜寡聚，觸發(fā)MOMP改變及后續(xù)細胞色素C釋放而啟動線粒體凋亡過程[12]（見圖1）。

圖1 Bcl-2抑制劑的作用機制[12]

VEN在髓系腫瘤治療中關鍵的臨床試驗

截至目前VEN后期研發(fā)經(jīng)歷了Ⅰ～Ⅲ期共4項關鍵性研究，即Ⅱ期VEN單藥治療復發(fā)/難治性AMLⅡ期臨床試驗（M14-212），Ⅰb/Ⅱ期針對年齡≥65歲不符合標準誘導治療的新診斷的AML患者VEN聯(lián)合去甲基化藥物的研究（M14-358，NCT02203773），一項與不適合標準誘導治療的AML減低劑量阿糖胞苷（lose-dose cytarabine,LDAC）聯(lián)合VENⅡ期臨床試驗（M14-387，NCT02287233），及快速上市后Ⅲ期、不適合誘導化療的新診斷老年AML患者中聯(lián)合標準劑量的阿扎胞苷（azacitidine，AZA）與AZA單藥的多中心隨機雙盲安慰劑對照研究（Viale-A）。上述基于不同人群所獲得的循證證據(jù)顯示，VEN有助于滿足目前AML治療中不適合標準化療、不良預后細胞遺傳學/分子學組AML患者誘導治療的需求及增加復發(fā)/難治性AML低強度治療的選擇。

一、VEN單藥試驗

基于臨床前數(shù)據(jù)，研究者首先啟動了VEN單藥治療復發(fā)/難治性AMLⅡ期臨床試驗（M14-212）。VEN逐日劑量爬坡至目標劑量800 mg/d，共32例患者入組，給予VEN直到疾病進展或不可接受的毒性[12]。中位年齡為71（19～84）歲，基線41%的患者先前接受過≥3種誘導方案。62%的患者具有復雜或del（7q）不良預后核型特征。最終5例患者獲得總體反應，1例獲得完全緩解（complete response，CR），4例血液學不完全恢復的緩解（CR with incomplete hematologic recovery，CRi），另有19%的患者出現(xiàn)原始細胞減少但未達反應標準。療效持續(xù)時間較短，中位進展時間為2.5個月。對進展或在800 mg劑量下缺乏反應的患者，將VEN劑量增加到1 200 mg/d，也未再顯示出治療活性。VEN治療耐受性AML良好，常見毒性為1、2級胃腸道不良反應、感染，以及＜30%的患者出現(xiàn)3、4級中性粒細胞減少性發(fā)熱。該研究額外對其中12例患者進行骨髓基線BH3特征分析，探索VEN的療效預測因素，結果證實原始細胞凋亡對Bcl-2依賴可獲得較好的臨床反應。但相較而言，對抗凋亡蛋白家族中其他成員Bcl-xL或Mcl-1不依賴則是更好的VEN單藥反應和療效持續(xù)的預測因素。因此提示，細胞依賴Bcl-xL或Mcl-1的凋亡可能是VEN復發(fā)耐藥的因素之一。這些結果還表明，有別于CLL凋亡表現(xiàn)出單一依賴Bcl-2蛋白，髓系腫瘤凋亡對抗凋亡蛋白的依賴表現(xiàn)出異質性，可不同程度地依賴多種抗凋亡蛋白如Bcl-xL或Mcl-1[12]。

二、VEN聯(lián)合用藥

雖然VEN單藥顯示出一定藥物活性和安全性，但有限和短暫的療效反應及髓系腫瘤中對抗凋亡蛋白依賴的異質性結果促使探索聯(lián)合用藥。首先嘗試AML中已標準使用且臨床前數(shù)據(jù)支持的藥物聯(lián)合。體外AZA可降低的Mcl-1蛋白表達水平和誘導凋亡敏化劑PUMA的表達，已知Mcl-1在VEN耐藥機制中起關鍵作用，可抵抗VEN的促凋亡作用，而兩藥聯(lián)合可發(fā)揮協(xié)同活性[13]。此外，當VEN與標準誘導藥物阿糖胞苷和伊達比星聯(lián)合時，也能協(xié)同抑制Mcl-1表達，誘導細胞凋亡[14]。VEN聯(lián)合AZA可破壞白血病干細胞的代謝途徑，特別是在三羧酸循環(huán)中，觀察到α-酮戊二酸降低和琥珀酸水平升高[15]。

基于上述臨床前研究，研發(fā)者開展了一項Ⅰb/Ⅱ期針對145例（≥65歲）中不符合標準誘導治療的新診斷AML患者VEN聯(lián)合去甲基化藥物（AZA或地西他濱）的研究（M14-358，NCT02203773），該組合未增加去加甲基化藥物單藥誘導毒性[16]。最常見的嚴重治療相關不良反應是發(fā)熱性中性粒細胞減少癥和常見的與骨髓抑制有關的3、4級不良反應。未記錄到腫瘤溶解綜合征事件，早期（30 d）治療相關死亡率低（3.4%）。但該組合具有高度的治療活性，CR/CRi率67%，總反應率為83%，中位總生存（overall survival，OS）期為17.5個月，2年OS率估計為46%。亞組分析顯示雖然那些較差的細胞遺傳學風險和TP53突變在該研究中的療效反應也不如其他組，但仍獲得了進步的反應。TP53突變患者獲得47%的CR/CRi率，與報道CR率低至28%的歷史對照[17]相比，盡管反應持續(xù)時間很短（中位反應持續(xù)時間5.6個月），但仍可能意味著改進。在該研究中，無論是多因素分析還是單因素分析，F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3（Fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）突變都不是不良結果的預后。核仁磷蛋白1（nucleophosmin 1，NPM1）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）1/2突變患者療效相對較好，提示VEN在IDH1突變患者中敏感性增加。

與此同時，另一項與不適合標準誘導治療的AML傳統(tǒng)次選方案即LDAC聯(lián)合VEN的臨床試驗（M14-387，NCT02287233）同時進行評估。Ⅰ/Ⅱ期試驗的結果顯示，在82例入組患者顯示出可接受的安全性（6%的早期死亡率、34%的3～4級發(fā)熱性中性粒細胞減少癥）和較滿意的療效，CR/CRi率為54%，中位OS期為10.1個月。亞組分析先前未接受去甲基化藥物治療患者的反應率較高（CR/CRi 62%、中位OS期13.5個月），高危分子特征TP53或FLT3突變患者組反應率低下（CR/CRi 30%），所有NPM1或IDH1/2突變的患者治療都有反應（CR/CRi 89%和72%）[18]。

上述2項Ⅰ/Ⅱ期試驗結果超出了AZA單藥AZA 001注冊試驗獲得的CR/CRi為28%、中位OS期為10.4個月的歷史結果[17]。因這些令人鼓舞的結果，VEN聯(lián)合AZA組合方案于2017年初獲得了美國食品和藥品管理局“突破性設計”的評價，并通過快速通道獲批上市。隨后繼續(xù)進行了一項Ⅲ期多中心隨機雙盲安慰劑對照注冊研究 （Viale-A）[19]，VEN在不適合誘導化療的新診斷老年AML患者中加標準劑量的AZA與單獨AZA，在北美、歐洲及中國已完成，研究共隨機入組患者431例，286例接受VEN+AZA，145例接受AZA+安慰劑治療。結果顯示研究組CR率為36.7%，明顯高于對照組17.9%，且試驗組提高中位OS期50%，長達14.7個月，而對照組為9.6個月，研究還觀察到可顯著提高不同基因突變患者（IDH1/2、FLT3、NPM1及TP53）的緩解率，在緩解深度上試驗組微小殘留病陰性率為23.4%，對照組僅為7.6%。數(shù)據(jù)申報后美國食品藥品管理局于2020年10月正式批準該適應證。VEN聯(lián)合LDAC方案近期也已完成了211例新診斷不適合標準誘導治療的AML多中心Ⅲ期安慰劑隨機對照研究（NCT03069352）[20]，進一步證實了VEN聯(lián)合LDAC較單獨LDAC獲得反應率和OS的改善及安全性。VEN聯(lián)合去甲基化藥物或LDAC因上述證據(jù)成為美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡更新指南中不適合標準化療、不良預后細胞遺傳學/分子學組AML患者及復發(fā)/難治性AML患者低強度治療的一線推薦方案。

綜上，基于臨床前和注冊研究結果，靶向Bcl-2已成為對AML有效和耐受性好的臨床治療方案。VEN聯(lián)合去甲基化藥物和LDAC獲批將成為前述適應證患者的一類首選。但是值得注意的是，Bcl-2并非髓系腫瘤特異的突變，Bcl-2蛋白在髓系腫瘤中表達并不一致，髓系腫瘤的凋亡也不完全依賴于Bcl-2蛋白，由此顯現(xiàn)出VEN對于髓系腫瘤體外敏感性不一致及單藥臨床試驗較低的療效及反應持續(xù)時間。VEN的靶向效應并非關鍵的“靶眼”，聯(lián)合治療是必要的。未來與IDH1/IDH2、FLT3等其他特定靶基因的小分子抑制劑及其他抗凋亡蛋白抑制劑如Mcl-1轉錄抑制蛋白-細胞周期蛋白依賴性激酶9（cyclin-dependent kinase 9，CDK9）抑制劑聯(lián)合應用，將開啟基于髓系腫瘤生物標志物治療策略新時代，改善髓系腫瘤的整體療效。