詹揚，萬建華，李穎萌，楊妮，曹星辰，胡旭，劉文君

(江中藥業(yè)股份有限公司，南昌330004)

0 引言

腸道菌群是指分布在腸道的微生物菌群，它們與腸道系統(tǒng)共同構成了腸道微生態(tài)，是維持腸道正常功能的基本保障[1]。腸道菌群失調是一些全身性疾病和消化系統(tǒng)疾病發(fā)生的病因或相關因素，其與消化系統(tǒng)疾病的關系是目前的研究熱點，長期大量使用廣譜抗生素導致腸道菌群紊亂極易發(fā)生藥源性腹瀉[2]，稱為抗生素相關性腹瀉（AAD），是抗生素使用常見的藥物副作用[2-3]。近年來，廣譜抗生素的大量使用導致AAD的發(fā)生率逐步增高，在接受抗生素治療的住院兒童約20%發(fā)生抗生素相關性腹瀉[4]。乳酸菌素是一種純乳酸菌代謝產生的，將脫脂乳經殺菌和真空濃縮后，再經乳酸菌發(fā)酵后干燥而制成的乳酸菌代謝產物混價粉狀物[5]，是改善腸道環(huán)境和調節(jié)腸道功能的傳統(tǒng)藥物，具有熱穩(wěn)定性和耐熱性，不受加工條件限制，安全性高，相比益生菌制劑其價格低廉易儲藏。隨著廣譜抗生素的應用，近年來AAD的發(fā)生率呈逐漸增多的趨勢，其臨床表現輕重不一，可出現腹瀉、腸炎更甚者可引起死亡，同時使患者住院時間延長、經濟負擔加重，是臨床丞待解決的問題。乳酸菌素片是常用的調節(jié)腸道功能的非處方藥物，本研究基于測序技術通過大鼠盲腸內容物樣本的腸道微生物揭示出乳酸菌素通過干預腸道微生物達到治療腹瀉的作用，對引起腹瀉的腸道致病菌具有明顯的抑制作用，阻止病原菌侵襲，保護并促進有益菌的生長，對于維持腸道正常微生態(tài)水平的有益菌具有明顯的增殖作用，為臨床抗生素應用導致的腸道問題提供有效的解決方案。

1 材料和方法

1.1 試劑

硫酸慶大霉素(含量≥590 U/mg，批號：20190122）,福安藥業(yè)集團煙臺只楚藥業(yè)有限公司；鹽酸林可霉素（含量≥90%，批號：20180818），河南新鄉(xiāng)華星藥廠；乳酸菌素片（批號：18059061，含量：按乳酸菌素計0.4 g/片），江中藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器

Secura225D-1CN型電子天秤，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；電子數顯卡尺（規(guī)格：0.01mm），南京蘇測計量儀器有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級昆明小鼠40只，22～25 g，雄性，許可證號：SCXK（贛）2018-0003，購自江西中醫(yī)藥大學，適應性飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心SPF級動物房。

1.4 試驗方法

1.4.1 小鼠腸道菌群失調腹瀉模型建立

SPF級雄性昆明小鼠40只，其中16只為正常組，剩余24只造模。正常組按0.5 mL/只的劑量灌胃無菌水，造模組灌胃濃度為0.4 g/mL的硫酸慶大霉素和鹽酸林可霉素各50%的復配液，0.5 mL/只，每日灌胃2次，連續(xù)6 d，小鼠糞便變得軟濕，呈黃綠色水樣便，則說明造模成功[6-7]。

1.4.2 分組及給藥

根據排便情況選取16只造模成功的腹瀉小鼠隨機平分為模型組和乳酸菌素片組，乳酸菌素片組日給藥劑量（按乳酸菌素計）為：1.2 g/kg，藥片用研缽研碎后加無菌水溶解制成混懸液，藥液濃度為0.024 g/mL，灌胃量0.5 mL/次，每日灌胃2次?？瞻捉M和模型組灌胃無菌水0.5 m L/次，每日2次，共給藥5 d，第6天時，每組取8只小鼠收集盲腸內容物暫存于液氮罐中備檢。

1.4.3 樣品采集

分別在造模結束后取正常組和造模組及給藥5 d后模型組和乳酸菌素片組的各8只小鼠盲腸內容物立即置于液氮中保存。

1.4.4 一般情況觀察

小鼠每日稱體質量，由于腹瀉小鼠盲腸脹大明顯，所以給藥結束后將盲腸結扎后剪下稱重，游標卡尺測量盲腸長度，然后于超凈工作臺中取完盲腸內容物后，再將盲腸稱重，通過2次稱重差值計算盲腸內容物重量[8]。

1.4.5 小鼠腸道微生物16SrRNA基因高通量測序

測定取0.2 g小鼠盲腸內容物，進行微生物群落總DNA抽提和16SrRNA基因的V3-V4區(qū)進行PCR擴增。利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序。對原始數據進行質控及優(yōu)化序列，優(yōu)化序列按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列；將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。然后，以OTU表格為基礎進行物種分類，生成系統(tǒng)發(fā)育樹，并對樣品各水平相對豐度進行劃分；依據OTU表格數據進行每個文庫多樣性分析，并利用R軟件（Version 3.4.2）繪制稀釋曲線、Rank-Abundance曲線、Chao1指數箱線圖以及Shannon指數箱線圖。

1.4.6 統(tǒng)計分析

各組數據用平均值±標準差表示，正常組與模型組及模型組與給藥組比較均采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，以P＜0.05為差異顯著。腸道菌群多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student’s t-test檢驗0.01＜P≤0.05標記為*，0.001＜P≤0.01標記為**，P≤0.001標記為***。

2 結果

2.1 不同組別小鼠體重、排便狀況、盲腸內容物指數等的差異性比較

與正常組相比，模型組給予抗生素造模6 d后，模型組小鼠采食量下降，被毛豎立，扎堆現象嚴重，肛周黏附軟濕糞便，應激排便呈黃綠色水樣便，少許夾有血絲，個別出現脫肛，正常組未見明顯異常。已知小鼠腹瀉狀態(tài)下其盲腸重量、盲腸指數和盲腸內容物指數與正常組相比顯著增大，模型組與正常組相比盲腸長度、體重、盲腸重量等顯著增大（P＜0.001），結果見表1，說明抗生素腹瀉模型造模成功[8]。

表1 造模6 d后，模型組與正常組相比一般情況比較(n=8，x±s)

給藥5 d后，模型組小鼠糞便仍呈輕微濕軟狀態(tài)，成形性較差，乳酸菌素片組的小鼠糞便成形性及硬度明顯優(yōu)于模型組，同時，小鼠的盲腸重量、盲腸指數和盲腸內容物指數和模型組相比顯著減?。≒＜0.01、P＜0.001，P=0.0001/0.00003/0.0040），結果見表2，表明乳酸菌素組給藥5 d后可明顯改善腹瀉小鼠腸道狀態(tài)。

表2 給藥5 d后，模型組與乳酸菌素片組相比一般情況比較(n=8，x±s)

2.2 乳酸菌素片給藥5 d后對小鼠腸道微生物多樣性的影響分析

2.2.1 測序結果質量分析

由圖1（a）可知，隨著測序深度的增加，觀測物種的指數曲線趨于平緩，說明當前測序深度足以發(fā)現各盲腸內容物樣本中的大部分物種。同時，從圖1（b）中反映物種豐富度及均勻度的Rank-Abundance曲線可以看出，隨著OUT等級的增加，曲線愈加平坦并在橫軸的跨度也越來越大，說明樣品中物種的均勻度和相對豐度都達到了很高的水平。

圖1 樣品多樣性指數分析

2.2.2 Pan/Core物種分析

Pan/Core物種分析能判斷樣本量是否充足并且評估樣品中物種豐富度和核心物種數。根據Pan/Core物種曲線是否平緩，從而評估測序樣本量是否足夠。圖2（a）、圖2（b）中隨著樣本量增加，曲線趨于平滑，說明各組樣本量充足。灌胃純水5 d后模型組的曲線位于最下端，其總物種豐富度和核心物種數量最低。給藥組總物種豐富度和核心物種數也較低，但相比模型組有所升高。

圖2 各組腸道菌群α多樣性變化

2.2.3 腸道菌群Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可采用群落多樣性指數包括Simpson指數和Shannon指數表示。造模結束后和乳酸菌素片給藥5 d后對模型組小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數的影響結果見圖3，造模結束后，與對照組比較，模型組Simpson指數顯著升高且Shannon指數顯著降低（0.3281±0.26635vs0.05601±0.01865，2.3129±1.2085 vs 3.9018±0.1564，P＜0.05，P=0.0354/0.0130），說明抗生素致腹瀉模型小鼠腸道菌群豐富度和群落中個體分配上的均勻性都顯著降低，抗生素致腸道菌群紊亂型腹瀉小鼠模型造模成功，由于個體差異性，模型組造模6 d后腸道群落多樣性指數差異較大，停止抗生素干預5 d后模型組腸道群落多樣性指數的差異性逐漸減少，說明小鼠腸道內菌群自身在不斷調整。乳酸菌素片組與模型組比較，Simpson指數顯著降低且Shannon指數顯著升高（0.4918±0.0606vs0.2098±0.03812，1.1219±0.12825 vs 2.2167±0.2098，P＜0.0001，P=9.211×10-8/1.432×10-8），說明乳酸菌素能顯著提高腸道菌群紊亂型腹瀉小鼠的腸道菌群多樣性。

圖3 模型組小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數

2.2.4 腸道菌群結構與組成分析

PCA得分圖（見圖4）中PC1和PC2對總體方差解釋的百分比分別為46.49%和24.81%，PCoA得分圖（見圖5）中PC1和PC2對總體方差解釋的百分比分別為41.6%和24.6%，模型組樣本點與正常組樣本點可以完全分開，模型組樣本點差異較大，結果和Alpha多樣性結果吻合，表明抗生素致小鼠腸道菌群紊亂模型造模成功。模型組樣本點與乳酸菌素片組樣本點完全分開，說明乳酸菌素片組腸道菌群的整體結構與組成相比模型組發(fā)生了較大變化。

圖4 PCA分析圖

圖5 PCoA分析圖

2.2.5 乳酸菌素片對腸道菌群整體結構的影響

按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，在種水平下各組樣本中豐度前10的物種組成情況見圖6，活潑瘤胃球菌屬（unclassified_g_[Ruminococcus]_Gnavus_group）、梭狀芽孢桿菌_ND 2（Clostridium_sp._ND2）、生酸擬桿菌（Bacteroides_acidifaciens）、未分類的類桿菌（unclassified_g_Bacteroides）、不可培養(yǎng)的另枝菌（uncultured_bacterium_g_Alistipes）、腸球菌屬（Enterococcus_casseliflavus_g_Enterococcus）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia_mannitolilytica）、志 賀 氏 菌 屬（Escherichia_coil_Escherichia-Shigella）、未分類的乳酸桿菌屬（unclassified_g_Lactobacillus）、不可培養(yǎng)的無毒梭菌（uncultured_bacterium_g_[Clostridium]_innocuum_group）、不可培養(yǎng)的未分類的鼠桿菌科（uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae），乳酸菌素片組腸道菌群組成與模型組有較大差異。

圖6 種水平下各組樣本腸道菌群的相對豐度

2.2.6 腸道菌群物種差異分析

根據腸道菌群整體結構分析發(fā)現，乳酸菌素片組與模型組的腸道菌群多樣性具有較大差異，乳酸菌素片的干預使得抗生素致腹瀉小鼠腸道菌群結構的組成發(fā)生了改變，為了比較乳酸菌素片干預后造成腸道微生物多樣性差異的關鍵菌屬，進一步在屬水平下比較乳酸菌素片組與模型組豐度前10的物種差異性，組間差異性檢驗結果見圖7，乳酸菌素片組與模型組比較有害菌豐度顯著降低（(62.06±15.95)%vs(27.78±11.43)%，(7.062±4.134)%vs(1.497±0.5112)%，P＜0.01，P=0.0031/0.0015）的有兩個，包括活潑瘤胃球菌屬（[Ruminococcus]_Gnavus_group）、無 害 梭 菌 組 屬（[Clostridium]_Innocuum_group），有益菌豐度顯著增加（(0.01927±0.048)%vs(14.58±10.3)%，(1.265±2.936)%vs(3.203±1.366)%，P＜0.05，P=0.0014/0.0177）的有兩個，包括腸球菌屬（Enterococcus）、糞芽孢菌屬（Coprobacillus）。腸道正常菌屬豐度顯著增加（(1.108±2.229)%vs(3.339±3.041)%，(0.1032±0.1816)%vs(3.024±3.97)%，(0.3366±0.1864)%vs(1.561±1.666)%，P＜0.05，P=0.0230/0.0065/0.0240）的有3個，包括布勞特氏菌屬（Blautia）、無嗅梭菌屬（Lachnoclostridium）、未 分 類 的 毛 螺 菌 屬（unclassified_f_Lachnospiraceae）。

圖7 乳酸菌素片組與模型組屬水平下關鍵菌屬差異性比較

3 結果與討論

本研究采用抗生素干預小鼠腸道使其菌群組成嚴重破壞，模擬臨床抗生素致腹瀉患者的腸道微環(huán)境，在給予乳酸菌素5 d后，乳酸菌素片組的小鼠腹瀉狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組，進一步采用16SrRNA基因測序技術對乳酸菌素對AAD小鼠的作用做了菌群水平的系統(tǒng)解析和關鍵菌屬的差異性比較。結果顯示，乳酸菌素片組給藥5 d后AAD小鼠的腸道菌群多樣性及物種豐度和模型組相比已有了顯著升高，其腸道菌群結構和組成與模型組相比有較大差異，進一步的腸道菌群整體結構分析可知，剛造模結束的模型組和自然恢復5 d后模型組之間也存在較大差異，說明停止抗生素干預后小鼠腸道菌群變化過程也較快，進一步物種的組成分析及豐度前10的物種差異分析可知，乳酸菌素片組的活潑瘤胃球菌屬（[Ruminococcus]_Gnavus_group）和無害梭菌組屬（[Clostridium]_Innocuum_group）相比模型組極顯著性降低，其中無害梭菌組屬（[Clostridium]_Innocuum_group）是引起抗生素相關性腹瀉的典型致病菌[9-10]?；顫娏鑫盖蚓鷮俸投喾N腸道疾病相關如炎性腸病[11]、克羅恩腸炎[12]、憩室炎[13]等。乳酸菌素是乳酸菌在代謝過程中產生的具有益生功效的代謝產物稱為后生元[14]，前期已有研究證明乳酸菌在代謝過程中可產生過氧化氫，同時可產生氧化性中間產物，抑制病原菌的生長繁殖[15]，本文首次在腸道菌群的角度證明乳酸菌素對活潑瘤胃球菌屬和無害梭菌屬具有明顯的抑制作用。

乳酸菌素片組相比模型組的腸球菌屬（Enterococcus）、無嗅梭菌屬（Lachnoclostridium）、布勞特氏菌屬（Blautia）和毛螺菌屬（Lachnospiraceae）都有顯著升高（P＜0.05）。腸球菌屬（Enterococcus）[16]是在哺乳動物腸道內廣泛存在的兼性厭氧型腸道菌，包括糞腸球菌、鳥腸球菌、希臘腸球菌等多種類型，是人類及動物體內正常菌群的重要組成部分。毛螺菌屬（Lachnospiraceae）為腸道有益菌，可將復雜的多糖降解為短鏈脂肪酸，如乙酸丁酸和丙酸，從而為宿主提供能量[17]。無嗅梭菌屬（Lachnoclostridium）和布勞特氏菌屬（Blautia）均屬于厚壁菌門的腸道常見菌。由此可見，乳酸菌素可快速調整抗生素致腹瀉小鼠的腸道菌群紊亂結構，使菌群的多樣性增加，抑制或殺滅典型腹瀉相關菌屬，增加腸道有益菌和正常菌豐度。

本研究側重于乳酸菌素對腸道菌群紊亂小鼠腸道菌生長增殖的影響，對于具體作用機制研究不足，16SrRNA基因分析主要是對基因高變區(qū)進行分析測序，通常是屬水平，屬于較高的分類學水平，無法有效鑒定到種水平，對于具體功能研究有較大限制。