盛蕾，童鑄廷

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科，安徽 合肥 230032)

0 引言

食管癌的發(fā)病率在全球惡性腫瘤中排名第八，尤其以發(fā)展中國家常見。其死亡率在全球惡性腫瘤中排名第六，2018年約有500000人死于食管癌[1]。我國的食管癌5年總生存率約為20%左右[2]。在我國，食管癌的主要病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，約占食管癌患者總數(shù)的90%[3]。大多數(shù)食管癌患者在就診時(shí)已進(jìn)展為中晚期，目前已明確的同步放化療是治療中晚期食管癌的標(biāo)準(zhǔn)療法[4]，但仍有部分患者會發(fā)生局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其中放療抵抗被認(rèn)為是治療失敗的重要原因之一[5]。因此，尋找有關(guān)食管癌放療抵抗的新型標(biāo)志物，對預(yù)測食管癌的預(yù)后和提供新的治療方向具有深遠(yuǎn)的意義。

三結(jié)構(gòu)域蛋白28(tripartite motif-containing 28，TRIM28)是含人三方基序(tripartite motif-containing protein，TRIM)蛋白質(zhì)家族的重要成員，也被稱為KRAB相關(guān)蛋白1((Krüppel-Associated Box-Associated Protein)1，KAP1)或轉(zhuǎn)錄中間因子1β(transcription intermediary factor 1 beta，TIF1-β)[6]。TRIM28不僅是正常發(fā)育和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。且在大部分腫瘤中，TRIM28蛋白表達(dá)水平增高，患者的生存率顯著降低[6]。

本文旨在探討TRIM28在放療的食管癌患者中的表達(dá)、預(yù)后及與食管癌放療抵抗的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑

人食管鱗癌細(xì)胞株Kyse30購自上海普諾賽生命科技有限公司；TIF1-β(TRIM28)(C42G12，兔單克隆抗體)購自Cell Signaling Technology；Alpha tubulin(No. 66031-1-Ig，鼠單克隆抗體)購自ProteinTech；蛋白裂解液和 BCA 蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物公司；0.25% 胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA)、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均來源于美國GIBCO公司；免疫組化使用通用型SP9000試劑及DAB顯色劑均來源于北京中杉金橋公司。根據(jù)試劑使用說明書推薦實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。

1.2 方法

1.2.1 材料

收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年1月至2015年8月就診的72例食管鱗癌患者的臨床資料及食管癌活檢標(biāo)本。另收集35例正常食管黏膜組織標(biāo)本作為正常對照。根據(jù)美國腫瘤聯(lián)合委員會(AJCC，2017)的TNM分類第8版[8]對患者進(jìn)行相關(guān)組織學(xué)分型和臨床病理分期。所有患者均為首發(fā)食管癌，且均只行同步放化療。

1.2.2 免疫組化

選取的食管癌活檢組織和食管正常粘膜組織均經(jīng)10% 中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4μm厚度連續(xù)切片，脫蠟后染色，具體操作步驟按照SP900試劑盒說明書進(jìn)行。同時(shí)以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。免疫組化結(jié)果由兩位病理科副主任醫(yī)師采用獨(dú)立雙盲原則進(jìn)行判定，計(jì)數(shù)高倍視野(400x)內(nèi)陽性細(xì)胞占比，取平均值計(jì)算閱片結(jié)果。TRIM28陽性主要定位于細(xì)胞核，陽性閾值定義為陽性細(xì)胞數(shù)>10%，且無論細(xì)胞核染色強(qiáng)度。TRIM28陽性表達(dá)高低標(biāo)準(zhǔn)為：陽性細(xì)胞數(shù)<10% 為0分，10%～49% 為1分；50%～74% 為2分；≥ 75% 為3。染色強(qiáng)度則依據(jù)染色的深度為標(biāo)準(zhǔn)：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：<3分為低表達(dá)，≥ 3分為高表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人食管鱗癌細(xì)胞株Kyse30用含有10% 胎牛血清的RPMI Medium-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于37 ℃，100% 濕度，含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1-2 d后觀察細(xì)胞的狀態(tài)和密度，適時(shí)更換培養(yǎng)基，定期進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.4 放射線處理細(xì)胞株

取在對數(shù)生長期的Kyse30細(xì)胞株，用0.25%胰酶將細(xì)胞團(tuán)塊消化，制備成單細(xì)胞懸液，均勻地鋪在6cm培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞呈指數(shù)生長時(shí)傳代，以1:2的比例穩(wěn)定傳代兩次后，隨機(jī)分為對照組和照射組。80%面積被照射組細(xì)胞長滿時(shí)，將細(xì)胞暴露在6Gy的能量輻射中。然后將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)兩周后提取蛋白。對照組在相同環(huán)境中培養(yǎng)，但不經(jīng)射線處理。源皮距(SSD)為100cm，照射面積為20cm×20 cm。

1.2.5 免疫蛋白印跡

收集待檢測Kyse30細(xì)胞，使用1?PBS緩沖液將細(xì)胞清洗兩次，在細(xì)胞中加入適量蛋白裂解液來提取細(xì)胞蛋白，采用BCA法測定所提取的蛋白濃度。使用8% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，在350mA恒流，轉(zhuǎn)膜90min的條件下轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜置于5% 脫脂牛奶中室溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜。第二天使用TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1h，再使用TBST洗膜3次。漂洗結(jié)束后加入顯影液避光顯影并采集圖像。

1.2.6 放療后近期療效評估

放療后4周，利用X線食管造影和CT有效評估放療對食管癌原發(fā)病灶的治療效果[9]。具體評估標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 放療后近期療效評估

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

收集UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)中RNA-seq和食管癌類型的臨床數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析TRIM28 mRNA在人食管正常組織和食管鱗癌組織中的表達(dá)，并作圖。

應(yīng)用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.4.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對TRIM28在食管癌組織中的表達(dá)情況及與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，對食管癌放療抵抗影響因素采用Logistic回歸分析，生存分析采用GraphPad Prism 8.4.0軟件進(jìn)行K-M分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM28在食管癌及食管正常粘膜組織中的表達(dá)

在UALCAN數(shù)據(jù)庫中，TRIM28在11例正常食管黏膜組織中的檢測情況和在95例食管鱗癌組織中檢測情況被比較發(fā)現(xiàn)，TRIM28被癌組織和正常組織表達(dá)明顯差異(P<0.05)，結(jié)果見圖1。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，我們對72例食管鱗癌組織和35例正常食管粘膜組織進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果見圖2、表2。根據(jù)前文給出的染色評分標(biāo)準(zhǔn)，TRIM28在59例(81.94%)食管鱗癌組織中呈現(xiàn)陽性染色，且TRIM28主要在細(xì)胞核中內(nèi)檢測到，同時(shí)可見細(xì)胞核出現(xiàn)異型性。相反，僅12例(34.28%)食管正常粘膜組織染色被檢測到陽性，代表兩種組織間的表達(dá)差異的P值<0.05。

圖1 TRIM28 在正常食管組織及食管癌組織中的表達(dá)(與正常食管組織比較，P<0.05)

圖2 TRIM28在食管癌組織及正常粘膜組織中的表達(dá)情況

表2 TRIM28在ESCC和食管正常粘膜組織中的表達(dá)情況

2.2 TRIM28與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

在72例TRIM28表達(dá)陽性食管癌組織中，高表達(dá)33例(45.83%)，低表達(dá)39例(54.17%)，TRIM28表達(dá)狀態(tài)與患者性別(P=0.310)、年齡(P=0.057)、組織學(xué)分級(P=0.190)無明顯相關(guān)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與食管癌T分期(P=0.004)、N分期(P=0.016)、M分期(P=0.014)、腫瘤大小(P=0.034)、CRT反應(yīng)(P=0.001)、局部轉(zhuǎn)移(P=0.029)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.001)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 食管癌組織中TRIM28表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 TRIM28表達(dá)狀態(tài)與患者預(yù)后的關(guān)系

為了研究TRIM28表達(dá)高低是否與食管癌放療患者預(yù)后相關(guān)，本研究使用GraphPad prism 8.4.0進(jìn)行了生存分析。如圖3所示，高表達(dá)TRIM28的食管癌患者較低表達(dá)TRIM28的食管癌患者預(yù)后差，總體生存率低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.944，95% CI=1.034～3.652，P=0.013)。

圖3 使用GraphPad Prism 8.4.0 預(yù)測TRIM28蛋白表達(dá)高低與患者預(yù)后關(guān)系的相關(guān)性，TRIM28高表達(dá)組較低表達(dá)組預(yù)后差，總體生存率低，P=0.013。

2.4 TRIM28與食管癌放療敏感性的關(guān)系

由前得知，TRIM28與放療食管癌患者預(yù)后相關(guān)，且TRIM28表達(dá)越高患者預(yù)后越差，所以本研究組假設(shè)TRIM28通過影響食管癌放療敏感性從而影響患者預(yù)后。本研究組對兩組細(xì)胞密度相同的Ksye30細(xì)胞株分別行0Gy、6Gy照光，Western Blot結(jié)果顯示，照光后實(shí)驗(yàn)組Kyse30細(xì)胞株表達(dá)TRIM28蛋白明顯增多，提示TRIM28的表達(dá)與電離輻射相關(guān)(圖4)。進(jìn)一步分析與放療抵抗的相關(guān)因素，Logistic回歸分析顯示，TRIM28表達(dá)高低、N分期、M分期均是引起食管癌放療抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表4)。

表4 影響食管癌患者放療敏感性的因素

圖4 分別對兩組Kys30細(xì)胞照光，照光后TRIM28蛋白表達(dá)較前明顯增多。

3 討論

現(xiàn)如今，同步放化療已經(jīng)成為治療食管癌的重要方式之一[10]，而放療抵抗則是導(dǎo)致食管癌復(fù)發(fā)率升高或5年生存率下降的重要原因[11]。腫瘤放療抵抗的獲得是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要包括DNA修復(fù)蛋白的過表達(dá)，抵抗相關(guān)信號通路的異常激活，腫瘤血管生成，腫瘤干細(xì)胞和自噬等[12]。盡管對于食管癌放療抵抗的機(jī)制已有一定研究，但與TRIM28相關(guān)的研究目前仍處于未知階段。本文首次提出并證明了TRIM28表達(dá)與食管癌的放療抵抗相關(guān)。

TRIM28，是一種大型的多結(jié)構(gòu)域蛋白，分子量約為110kDa，屬于TRIM家族。TRIM28的氨基(N)末端包含四個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，其中包含RING指結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和一個(gè)亮氨酸拉鏈卷曲螺旋區(qū)域(CC)，這些區(qū)域統(tǒng)稱為RBCC或TRIM域[5]。TRIM28的羧基(C)端串聯(lián)PHD結(jié)構(gòu)域和溴結(jié)構(gòu)域(亦稱為PB結(jié)構(gòu)域)，主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能[7]。當(dāng)前的研究表明，TRIM28在細(xì)胞分化，DNA損傷反應(yīng)(DDR)，病毒復(fù)制，免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種方面均發(fā)揮重要作用[5,13]。近年來針對TRIM28與腫瘤的關(guān)系的研究越來越多。Yu等的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞株內(nèi)過表達(dá)TRIM28，可增加波形蛋白表達(dá)，同時(shí)降低E-鈣蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[14]。Joseph B.團(tuán)隊(duì)的研究也表明乳腺癌細(xì)胞株中過表達(dá)TRIM28與乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)[15]。除此之外，另一個(gè)研究揭示了TRIM28促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制通路，即通過與EZH2和SWI / SNF復(fù)合物結(jié)合促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的富集和維持，進(jìn)而引起乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲[16]。本研究通過免疫組化和免疫蛋白印跡方法，得出TRIM28與食管癌放療患者預(yù)后及放療抵抗相關(guān)。研究證明，TRIM28與電離輻射引起的雙鏈DNA損傷修復(fù)相關(guān)，而放療抵抗的原因之一就是雙鏈DNA損傷修復(fù)。電離輻射后，細(xì)胞內(nèi)ATM信號被激活，下游TRIM28被磷酸化(pTRIM28)并且濃聚在染色體損傷位點(diǎn)，舒張染色體，進(jìn)而促進(jìn)染色體修復(fù)[17]。與此同時(shí)，pTRIM28增多后，PP4C / R3b復(fù)合物激活介導(dǎo)pTRIM28去磷酸化，從而調(diào)節(jié)并穩(wěn)定TRIM28在DDR中的作用[18]。目前在本研究中，僅提出了TRIM28與放療抵抗相關(guān)，未進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明TRIM28調(diào)節(jié)DDR通路，相關(guān)放療抵抗通路仍待后續(xù)進(jìn)一步研究。

本文的研究結(jié)果顯示，TRIM28蛋白在食管癌組織中表達(dá)顯著高于正常食管粘膜組織，與劉博等的研究結(jié)果一致[19]。其次本研究組發(fā)現(xiàn)，TRIM28的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度均無明顯相關(guān)，與食管癌腫瘤的大小及TNM分期均有顯著相關(guān)，提示TRIM28在食管癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移上發(fā)揮作用，與TRIM28在其他腫瘤中的作用基本相似[15,20]。隨后研究發(fā)現(xiàn)TRIM28在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者中的表達(dá)水平顯著高于無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者，并且低表達(dá)患者顯示出更好的預(yù)后，說明TRIM28與放療后食管癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。此外，對放療反應(yīng)較差的患者的TRIM28表達(dá)顯著高于反應(yīng)較好的患者，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示，在食管癌患者中檢測TRIM28表達(dá)不僅有望成為預(yù)測同步放化療食管癌患者預(yù)后的新型標(biāo)志物，同時(shí)也有望成為預(yù)測食管癌放療抵抗的新指標(biāo)。

綜上所述，TRIM28影響著放療后食管癌患者的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及預(yù)后，且與食管癌的放療抵抗相關(guān)，也能夠?yàn)槭彻馨┗颊叩呐R床治療提供新的研究方向。