朱潔潔，顧康生

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 合肥 230032)

0 引言

最新全球數(shù)據(jù)顯示，胃癌(GC)是全球第五個(gè)最常見(jiàn)的腫瘤和腫瘤患者死亡的第三大原因[1]，是一個(gè)危害人類(lèi)健康的重大疾病。胃癌的治療方式包括手術(shù)、化療、分子靶向治療等，盡管胃癌治療取得了一些進(jìn)展，很多胃癌患者的生存期得以延長(zhǎng)，但大多數(shù)胃癌中晚期患者仍預(yù)后較差，其中與化療耐藥的產(chǎn)生息息相關(guān)。鉑類(lèi)為胃癌化療的一線藥物之一，探究其耐藥相關(guān)分子標(biāo)志物，對(duì)改善胃癌預(yù)后至關(guān)重要。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已有不少研究證實(shí)lncRNAs與胃癌預(yù)后相關(guān)，且參與了胃癌化療耐藥。本研究前期通過(guò)比較胃癌順鉑耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP與其親本細(xì)胞SGC7901之間lncRNA表達(dá)譜的差異，篩選出可能與GC細(xì)胞中鉑類(lèi)藥物耐藥密切相關(guān)的lncRNA CTD-2066L21.1，本研究旨在繼續(xù)探討其在胃癌鉑類(lèi)耐藥細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

總RNA提取試劑TRIZOL購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；lncRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑以及敲低、過(guò)表達(dá)慢病毒載體均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)公司；人類(lèi)胃癌細(xì)胞株SGC7901，和人胃黏膜上皮細(xì)胞 GES-1，均從中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)獲得；對(duì)順鉑耐藥的SGC7901/DDP細(xì)胞購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；10%胎牛血清、鏈霉素(100 g/mL)和青霉素(100 U/mL)、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；MTT、DMSO 購(gòu)自美國(guó) sigma公司；DEPC 水購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞保存在含10%胎牛血清、鏈霉素(100g/mL)和青霉素(100U/mL)的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。為了維持順鉑耐藥表型，將終濃度為800 ng/mL的順鉑加入到SGC7901/DDP細(xì)胞的培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)前將SGC7901/DDP細(xì)胞在無(wú)順鉑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周。

1.3 RNA提取及定量

嚴(yán)格按照TRIZOL試劑操作說(shuō)明提取人GC細(xì)胞的總RNA。PBS清洗3次細(xì)胞后加入TRIZOL試劑，冰上操作，吹打混懸后轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中，加入氯仿充分振蕩，于室溫下放置5min后離心，取上清液，加入預(yù)冷異丙醇，混勻后再離心，棄上清，加入無(wú)水乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥沉淀，加入適量的DEPC水溶解稀釋。取少量RNA溶液，用Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。當(dāng)A260/A280比值在1.8～2.0之間時(shí)，RNA純度較好。用DEPC稀釋定量RNA。

1.4 RT-PCR 檢測(cè)

lncRNA的RT-PCR按照RT-qPCR定量試劑盒(Gene Pharma)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，合成cDNA 第一鏈后，將反應(yīng)體系置于逆轉(zhuǎn)錄儀(LightCycler480)上，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。lncRNA CTD-2066L21.1的表達(dá)水平通過(guò)2-ΔΔCt表達(dá)。ΔCt為同一樣本中目的基因與內(nèi)參基因(β-actin) Ct 值的差值。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在12孔板的培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度30%-50%時(shí)，除去舊培養(yǎng)基，繼續(xù)接種在不含血清及雙抗的培養(yǎng)基，將構(gòu)建好的敲低或過(guò)表達(dá)lncRNA CTD-2066L21.1慢病毒載體(含有目的片段、GFP 熒光標(biāo)記、抗嘌呤霉素耐藥基因)，加入培養(yǎng)孔中。24 h 后，吸去孔中含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。72 h 后，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白 GFP 的表達(dá)，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。利用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以獲得純種的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，RTPCR法驗(yàn)證細(xì)胞目的基因過(guò)表達(dá)或敲低的效率；培養(yǎng)、傳代、保種，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞活性分析

將SGC7901/DDP細(xì)胞接種于96孔板上。24h后，順鉑濃度分別為40、20、2、0.2、0.02和0.002μg/mL處理SGC7901/DDP細(xì)胞48h。20μl MTT (5 mg/mL；SIGMA)被加入每個(gè)槽中。孵育4 h后，加入150μl二甲基亞砜(SIGMA)，輕輕搖勻10min。測(cè)定490 nm處的吸光度。利用SPSS 19.0軟件根據(jù)細(xì)胞活性計(jì)算順鉑的半抑制濃度(IC50)。所有操作至少重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

1.7 流氏細(xì)胞儀分析

采用膜聯(lián)蛋白V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BestBio)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)SGC7901/DDP和SGC7901細(xì)胞的凋亡率。對(duì)SGC7901/DDP細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞(～1×106細(xì)胞)分別用終濃度為0.8和0.3 g/mL的順鉑處理。在37℃下處理48h后，收集細(xì)胞并用冰PBS洗滌兩次。用400 μL的1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，密度最終維持在1×106個(gè)細(xì)胞/mL左右。加入5μL膜聯(lián)蛋白V-FITC，室溫避光下孵育15 min。然后在懸液中加入10μL PI，在室溫黑暗下孵育5min。最后，使用Gallios流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況(早期+晚期)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。采用t檢驗(yàn)(兩組)或單因素方差分析(ANOVA，超過(guò)兩組)來(lái)確定變量之間的差異。P值<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Graphpad軟件8.0繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA CTD-2066L21.1 在 SGC7901/DDP 細(xì)胞中明顯上調(diào)

本課題組前期將胃癌細(xì)胞株和胃癌耐藥細(xì)胞株中利用博奧晶芯 LncRNA+mRNA Human Gene Expression Microarray V4.0，4×180K 芯片進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)在胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP中下調(diào)的有223種，上調(diào)的有187種，這其中就包括上調(diào)的p13641(CTD-2066L21.1)(P<0.05，差異倍數(shù)≥2)。之后我們進(jìn)行RT-PCR法檢測(cè)，lncRNA CTD-2066L21.1在胃癌耐藥細(xì)胞株 SGC7901/DDP中的表達(dá)顯著高于胃癌親本細(xì)胞株 SGC7901，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。因此，我們猜測(cè)lncRNA CTD-2066L21.1與胃癌順鉑耐藥有關(guān)。

圖1 lncRNA CTD-2066L21.1 在 SGC7901/DDP 細(xì)胞中明顯上調(diào)。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染

為了進(jìn)一步探討lncRNA CTD-2066L21.1與胃癌順鉑耐藥之間的關(guān)系，本研究通過(guò)重組慢病毒過(guò)表達(dá)載體CTD-2066L21.1-mimic，轉(zhuǎn)染原本低表達(dá)的SGC7901細(xì)胞，用CTD-2066L21.1-siRNA下調(diào)SGC7901/DDP細(xì)胞中的CTD-2066L21.1表達(dá)，之后用嘌呤霉素篩選、RT-PCR驗(yàn)證，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞株。如圖2A所示，RT-PCR結(jié)果示轉(zhuǎn)染后的SGC7901細(xì)胞(SGC7901-CTD-2066L21.1-OE)CTD-2066L21.1表達(dá)量顯著高于普通未轉(zhuǎn)染的胃癌親本對(duì)照細(xì)胞(SGC7901)和對(duì)照載體(SGC7901-NC)(P<0.001)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功；用CTD-2066L21.1-siRNA轉(zhuǎn)染三種SGC7901/DDP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與SGC7901/DDP-CTD-184，和SGC7901/DDP-CTD-254相比，轉(zhuǎn)染后的分析結(jié)果顯示SGC7901/DDP-CTD-121敲除效率最佳(圖2B，P<0.01)，因此后續(xù)選擇SGC7901/DDPCTD-121繼續(xù)接下來(lái)的研究。

圖2 建立穩(wěn)定細(xì)胞株

2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

接下來(lái)我們通過(guò)細(xì)胞活力檢測(cè)研究過(guò)表達(dá)CTD-2066L21.1對(duì)SGC7901/DDP細(xì)胞順鉑耐藥性的影響。在體外分別以不同濃度的順鉑處理各組SGC7901/DDP細(xì)胞，48h后檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)CTD-2066L21.1后，SGC7901細(xì)胞的活力明顯增強(qiáng)；過(guò)表達(dá)組的半數(shù)抑制濃度(IC50)顯著高于陰性對(duì)照組(SGC7901-NC)和空白對(duì)照組(SGC7901)(圖3A，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在胃癌耐藥細(xì)胞中，敲除CTD-2066L21.1后，SGC7901/DDP-CTD-KD 細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性增加；過(guò)表達(dá)組的半數(shù)抑制濃度(IC50)顯著低于陰性對(duì)照組(SGC7901/DDP-NC)和空白對(duì)照組(SGC7901/DDP)(圖3B，P<0.01)，以上結(jié)果表明，CTD-2066L21.1的上調(diào)可降低胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，其下調(diào)能逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

圖3 (A)上調(diào)lncRNA CTD-2066L21.1可降低SGC7901細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性；P<0.01。(B)敲除lncRNA CTD-2066L21.1逆轉(zhuǎn)了SGC7901/DDP細(xì)胞中的順鉑耐藥；P<0.01。

2.4 流式細(xì)胞儀分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證，用流式細(xì)胞儀分析顯示SGC7901細(xì)胞和SGC7901/DDP在順鉑治療48h后(最終濃度為1μg/mL)的凋亡率。結(jié)果與細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，敲除lncRNA CTD-2066L21.1后的SGC7901/DDP細(xì)胞對(duì)DDP誘導(dǎo)的凋亡敏感性增加，凋亡率升高(P<0.001)；而上調(diào)lncRNA CTD-2066L21.1使SGC7901細(xì)胞順鉑誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞率減少，耐藥性增加(P<0.001)。

圖4 (A) 敲除lncRNA CTD-2066L21.1使SGC7901/DDP細(xì)胞對(duì)DDP誘導(dǎo)的凋亡敏感；P<0.001。(B) lncRNA CTD-2066L21.1上調(diào)使SGC7901細(xì)胞順鉑誘導(dǎo)的凋亡減少；P<0.001。

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，居我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤發(fā)病率第2位和死亡率第3位，是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。早期胃癌治療的首選的主要方式是根治性手術(shù)切除，但對(duì)于中晚期癌癥患者，手術(shù)不能完全切除病變。化療是人類(lèi)胃癌術(shù)后的主要治療策略，它可以一定程度上延長(zhǎng)患者生存期、改善預(yù)后。然而化療耐藥的產(chǎn)生極大地影響了療效。探究其分子標(biāo)志物，同時(shí)尋找化療耐藥分子靶標(biāo)成為研究熱點(diǎn)。

lncRNAs是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸但缺乏蛋白編碼能力的長(zhǎng)鏈非編碼RNA[2]。lncRNAs在哺乳動(dòng)物中主要由RNA聚合酶(RNAP) II或III轉(zhuǎn)錄，在植物中主要由RNAP IV和V轉(zhuǎn)錄[3,4]。由于高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)方法的廣泛應(yīng)用，在哺乳動(dòng)物和植物等許多生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了成千上萬(wàn)的lncRNAs。lncRNAs的功能包括基因印記、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等[5-9]。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已有不少研究證實(shí)lncRNAs在胃癌中廣泛表達(dá)，并影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及對(duì)化療的療效。MORIDI H[10]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NONHSAT062994在GC樣本組織中表達(dá)下調(diào)，并與組織學(xué)分級(jí)和腫瘤大小顯著相關(guān)，與年齡、性別、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管轉(zhuǎn)移和壞死無(wú)關(guān)。Hongbing Zhai[11]發(fā)現(xiàn)胃癌組織和細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA BCYRN1-27表達(dá)顯著升高，其中29例胃癌患者BCYRN1 - 27表達(dá)與腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)，單因素和多因素Cox回歸分析顯示，高BCYRN1- 27表達(dá)是胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。Wang L[12]在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)lncRNA 4(BCAR4)在順鉑耐藥細(xì)胞株(SGC7901/DDP)中的表達(dá)增強(qiáng)；BCAR4在SGC7901細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)增加了對(duì)順鉑的耐藥性，而降低BCAR4在SGC7901/DDP細(xì)胞中的表達(dá)，會(huì)提高對(duì)順鉑的敏感性。

CTD-2066L21.1 是一種基因間長(zhǎng)鏈非編碼 RNA，它是已知的新型 RNA，目前功能尚不明確。關(guān)于lncRNA CTD-2066L21.1在胃癌中的表達(dá)及其與細(xì)胞耐藥的影響，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道非常少。本課題組前期通過(guò)芯片檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)相比較普通胃癌細(xì)胞株，CTD-2066L21.1在胃癌耐藥細(xì)胞株 SGC7901/DDP 中明顯上調(diào)，由此我們推測(cè)CTD-2066L21.1 可能與胃癌細(xì)胞順鉑耐藥性有著密切的關(guān)聯(lián)。RT-PCR結(jié)果證實(shí)lncRNA CTD-2066L21.1在SGC7901/DDP中的表達(dá)顯著高于SGC7901，后通過(guò)重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染，在SGC7901中過(guò)表達(dá)lncRNA CTD-2066L21.1，細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性增強(qiáng)，凋亡率降低。而在SGC7901/DDP細(xì)胞中敲低lncRNA CTD-2066L21.1表達(dá)后，細(xì)胞的活性降低，凋亡率升高。因此，lncRNA CTD-2066L21.1的表達(dá)與胃癌順鉑耐藥相關(guān)，可能成為胃癌鉑類(lèi)耐藥潛在的分子標(biāo)志物。

4 結(jié)論

lncRNA CTD-2066L21.1上調(diào)可使胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性降低，其下調(diào)可逆轉(zhuǎn)SGC7901/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥性。