李智慧，姚菲菲，王富霞

（鄭州人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，鄭州 450000）

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌類型的80%[1-2]。經(jīng)過積極的手術(shù)切除、化學(xué)和放射治療后，局部未轉(zhuǎn)移患者的5年生存率約為55%，區(qū)域性疾病患者約為27%，遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移患者約為4%[3]。這主要由于早期就診率低且確診時大多處于晚期階段[4]。因此，尋找靈敏的腫瘤標(biāo)志物和有效的治療策略是亟待解決的問題。近年來，研究表明活化T細(xì)胞核因子（NFAT）參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。在前列腺癌中，活化T細(xì)胞c1核因子1（activated T cell c1 nuclear factor1，NFATc1）的表達(dá)水平增加，降低NFATc1的表達(dá)水平后，對膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用，可能是膀胱癌治療的有效靶點(diǎn)之一[6]。在卵巢癌中，NFATc1可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮致癌作用[7]。而在NSCLC中，對NFATc1的表達(dá)水平及可能發(fā)揮的作用機(jī)制研究較少，本研究主要檢測NFATc1在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平，利用轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低NFATc1的表達(dá)，進(jìn)一步分析NFATc1對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，為NSCLC的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料NSCLC細(xì)胞H1650、H460、H1299及正常人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B（上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）；RPMI1640培養(yǎng)基（北京鼎國有限公司）；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；NFATc1、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、β-actin一抗和二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；陰性對照質(zhì)粒（si-NC）、NFATc1干擾質(zhì)粒（si-NFATc1）和NFATc1 mimic質(zhì)粒由北京華大基因合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（qRT-PCR）提取H1650、H460、H1299和BEAS-2B細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時定量PCR。以管家基因GAPDH的mRNA水平作為內(nèi)參照。引物設(shè)計如下：NFATc1上游引物序列5′-CACCGCATCACAGGGAAGAC-3′，下游引物序列5′-GCACAGTCAATGACGGCTC-3′，GAPDH上游引物序列5′-AGAAAAACCTGCCAAATATGATGA C-3′，下游引物序列5′-TGGGTGTCGCTGTTGAAGT C-3′。反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，42個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.2 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的H1650細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，以104個/孔的密度接種于6孔細(xì)胞板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，分為si-NC組和si-NFATc1組，按照脂質(zhì)體lipofeetamine 2000說明書步驟操作，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，放置恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞利用qRT-PCR和Wenstern印跡檢測轉(zhuǎn)染效果，qRT-PCR具體實(shí)驗(yàn)操作見1.2.1，Wenstern印跡具體實(shí)驗(yàn)操作見1.2.3。

1.2.3 Western印跡實(shí)驗(yàn) 收集si-NC組、si-NFATc1組細(xì)胞加入適量蛋白裂解液，放置冰塊上裂解30 min。收集上清，利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。配置5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，滴加anti-NFATc1（1∶1 000）在4℃冰箱中過夜孵育。采用TBST溶液清洗3遍，每次10 min。之后滴加二抗（1∶4 000）室溫孵育1 h，采用TBST溶液清洗3遍，每次10 min。配置一定量的顯影液，均勻滴加在膜上，曝光拍照。

1.2.4 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)CCK-8試劑檢測細(xì)胞增殖情況，將si-NC組和si-NFATc1組細(xì)胞以每孔2×103的密度接種于96孔板中，每組細(xì)胞6個平行孔。饑餓過夜，然后更換含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。放置37℃、5%CO2條件的恒溫箱中培養(yǎng)，分別在更換培養(yǎng)基的12、24、36、48、60、72 h時，至于酶標(biāo)儀450 nm處檢測細(xì)胞光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 集落形成實(shí)驗(yàn) 將si-NC組和si-NFATc1組細(xì)胞懸液，反復(fù)吹打使細(xì)胞分散，按照每皿200個細(xì)胞的密度接種至培養(yǎng)皿中，以十字方向輕輕混勻，放置操作臺中靜置10 min，移至恒溫箱中培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)液pH值變化情況更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至肉眼可見的克隆形成，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，PBS溶液清洗1遍，加入3 mL甲醇固定15 min，然后用DAPI染料染色10 min，終止染色后PBS溶液清洗1遍，拍照并統(tǒng)計集落形成數(shù)量。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)si-NC組和si-NFATc1組細(xì)胞以30萬每孔的密度接種至6孔板中，放置恒溫箱中孵育24 h，用10 μL的槍頭至上從下劃一道傷痕，在顯微鏡下拍照。劃痕寬度為a值。更換培養(yǎng)基，以免劃掉的細(xì)胞再次脫落貼壁生長。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，放置顯微鏡下拍照，劃痕寬度為b值。細(xì)胞遷移率=（a-b）/a×100%。

1.2.7 Western印跡實(shí)驗(yàn) 收集si-NC組、si-NFATc1組細(xì)胞加入適量蛋白裂解液，放置冰塊上裂解30 min。收集上清，利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。配置5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，滴加anti-Vimentin、anti-N-cadherin、anti-E-cadherin抗體（1∶1 000），后續(xù)操作見1.2.3。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NFATc1在3種NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)H1650、H460、H1299細(xì)胞中NFATc1 mRNA的相對表達(dá)水平均高于BEAS-2B細(xì)胞（t=10.732，P<0.001；t=4.705，P=0.009；t=4.792，P=0.009），且H1650細(xì)胞中NFATc1 mRNA表達(dá)水平高于H460、H1299細(xì)胞（t=3.593，P=0.023；t=7.505，P=0.002），見圖1。

圖1 不同細(xì)胞系中NFATc1 mRNA的相對表達(dá)水平Fig 1 Relative expression of NFATc1 mRNA in different cell lines

2.2 驗(yàn)證si-NFATc1對H1650的敲低效率 將si-NC、si-NFATc1轉(zhuǎn)染至H1650細(xì)胞后，在mRNA和蛋白質(zhì)水平分別檢測敲低效率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-NFATc1組NFATc1 mRNA低于si-NC組（t=9.325，P<0.001），NFATc1蛋白灰度值低于si-NC組（t=10.254，P<0.001），見圖2。

圖2 特異性si-NFATc1對H1650的敲低效率Fig 2 Knockdown efficiency of specific si-NFATc1 on H1650

2.3 敲低NFATc1后可有效抑制H1650細(xì)胞的增殖 采用CCK8和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞的增殖能力，培養(yǎng)72 h si-NFATc1組細(xì)胞的OD值低于si-NC組（t=7.954，P<0.001），細(xì)胞集落形成數(shù)低于si-NC組（t=12.210，P<0.001），見圖3。

圖3 敲低NFATc1后對H1650細(xì)胞增殖的影響Fig 3 The effect of knocking down NFATc1 on the proliferation of H1650 cells

2.4 敲低NFATc1后可有效抑制H1650細(xì)胞的遷移 利用遷移實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的遷移率，結(jié)果顯示si-NFATc1組細(xì)胞的遷移率低于si-NC組（t=8.951，P<0.001），見圖4。

圖4 敲低NFATc1后對H1650細(xì)胞遷移的影響Fig 4 The effect of knocking down NFATc1 on the migration of H1650 cell

2.5 敲低NFATc1后可減弱H1650細(xì)胞的EMT能力 選擇Vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白水平評估EMT能力，Western印跡實(shí)驗(yàn)顯示si-NFATc1組E-cadherin蛋白水平高于si-NC組（t=6.352，P<0.001），Vimentin和N-cadherin蛋白的表達(dá)水平低于si-NC組（t=6.012，P<0.001；t=10.241，P<0.001），見圖5。

圖5 敲低NFATc1后對H1650細(xì)胞EMT的影響Fig 5 The effect of knocking down NFATc1 on EMT of H1650 cells

3 討論

NSCLC是最常見的肺癌，盡管其診治水平在不斷提高，但死亡率仍居高不下。因此，最重要的是研究肺癌發(fā)生、發(fā)展的潛在機(jī)制，并確定其診斷和治療的基因靶標(biāo)。NFAT蛋白屬于炎癥轉(zhuǎn)錄因子家族，主要在T細(xì)胞活化的背景下參與炎癥反應(yīng)。NFAT活性不僅限于免疫系統(tǒng)，還與幾種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。最近有多項研究顯示，NFATc1具有致癌性，NFATc1在前列腺癌的治療中具有一定的臨床價值，與卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)，可促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲[8-10]。但NFATc1在NSCLC中的作用機(jī)制目前研究還較少見，在本研究中發(fā)現(xiàn)NFATc1 mRNA水平在3種NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)水平均上調(diào)，并對EMT有影響。EMT是細(xì)胞失去上皮特征并獲得間質(zhì)特征的過程，通常由上皮標(biāo)志物E-cadherin的丟失和間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)增加來定義。上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力[11]。EMT與多種腫瘤功能有關(guān)，包括腫瘤發(fā)生、惡性進(jìn)展、腫瘤細(xì)胞遷移和對治療的抵抗性[12]。本研究中，敲低NFATc1表達(dá)水平后，增強(qiáng)了上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，減弱N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，表明NFATc1表達(dá)降低后可減弱NSCLC細(xì)胞EMT作用，以及腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

NFATc1在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)水平增加，推斷其在NSCLC中發(fā)揮促癌基因作用。LI等[13]研究顯示，在卵巢癌中NFATc1的表達(dá)水平增加，降低其表達(dá)水平后可顯著降低卵巢癌細(xì)胞在裸鼠中的增殖、遷移和侵襲能力，并減少卵巢癌的腫瘤發(fā)生。此外，在膀胱癌中亦觀察到NFATc1的高表達(dá)，NFATc1與根治性前列腺切除術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險之間存在相關(guān)性，表明NFATc1在膀胱癌發(fā)展過程中至關(guān)重要[14]。本研究中敲低NFATc1的表達(dá)后可明顯抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移，與以上的研究結(jié)果相一致。HE等[15]研究顯示，叉頭框蛋白C2可增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的增殖和EMT，有可能成為治療NSCLC的有效靶點(diǎn)。WANG等[16]研究顯示，Wnt5a可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞EMT和細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，有望成為治療NSCLC的有效靶點(diǎn)。FBXW7可抑制NSCLC細(xì)胞EMT和順鉑耐藥，增加FBXW7的表達(dá)水平有可能成為治療NSCLC的方法之一[17]。本研究中NFATc1在NSCLC中的表達(dá)水平增加，降低其表達(dá)水平后可顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移和EMT。

綜上所述，NFATc1在NSCLC中表達(dá)水平增加，發(fā)揮促癌基因的作用，降低NFATc1的表達(dá)水平后可抑制NSCLC細(xì)胞增殖和EMT。因此，NFATc1有望成為NSCLC治療的有效靶點(diǎn)。