高睿，鄭祥建

（天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系，天津 300070）

生發(fā)中心激酶Ⅲ（GCKⅢ）是Sterile 20家族蛋白亞群，包括STK24、STK25、MST4。它們在控制細胞周期、細胞凋亡、細胞遷移及黏附等過程中發(fā)揮重要作用。近幾年，GCKⅢ復合物被報道與很多臨床疾病相關(guān)，包括海綿狀腦血管畸形（CCM）[1]。CCM是較為常見的腦血管疾病，可引起卒中、頭痛、癲癇、腦出血，其致病基因為CCM1、CCM2、CCM3。在結(jié)構(gòu)上，CCM3通過其N-末端二聚化結(jié)構(gòu)域結(jié)合GCKⅢ，并且招募其他CCM相關(guān)基因（CCM2、CCM1）形成完整的復合體，在CCM病理生理中起到不可或缺的作用[2-3]。STK24、STK25、MST4是CCM致病基因的下游，在斑馬魚模型中敲除Stk24和Stk25基因后會引起與CCM3相似的心血管表型[4-5]。本研究致力于構(gòu)建血管內(nèi)皮特異性Stk24和Stk25雙基因敲除小鼠，為Stk24、Stk25基因敲除小鼠作為CCM疾病模型，進一步探討CCM致病通路提供堅實基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 實驗動物Cdh5creErt2工具鼠來自Ralf Adams實驗室，Stk24fl/fl小鼠由上海模式生物科技公司定制，Stk25fl/fl小鼠由本實驗室構(gòu)建制備。實驗過程中對小鼠的處置按照中華人民共和國科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定進行，符合動物倫理學管理要求。倫理批號：2017022501。

小鼠的飼養(yǎng)繁殖均在天津醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房中。屏障內(nèi)環(huán)境均符合國家對實驗動物環(huán)境設施的要求，溫度：20℃～26℃；相對濕度：40%～70%；12 h/12 h循環(huán)光照；墊料、籠器具均進行高壓真空滅菌，達到純凈無菌要求，動物采用自由飲水進食的方式；鼠籠的墊料隔天更換1次，保證小鼠居住環(huán)境的潔凈度。

1.2 主要試劑TRIzolTM試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司），2X GoTaq master Mix（Promega），瓊脂糖（北京索萊寶科技有限公司），DNA分子量標準指示劑（思科捷），實時定量qPCR mix（Genstar），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（genstar）血管內(nèi)皮特異磁珠（Miltenyi），膠原酶Ⅳ（sigma公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因打靶構(gòu)建基因工程小鼠 利用基因打靶技術(shù)分別構(gòu)建Stk24、Stk25轉(zhuǎn)基因小鼠。首先在Ensemble基因庫分析目標基因Stk24和Stk25。最終選定4號外顯子作為Stk24的目標靶點，3、4、5號外顯子作為Stk25的目標靶點，并且在3′和5′端適當位置插入loxp位點，如圖1所示，由此構(gòu)建目標基因載體。隨后在ES細胞達到指數(shù)增長時期時，使用電擊法將目標基因載體轉(zhuǎn)到ES細胞中，完成陽性篩選后將陽性克隆注射入小鼠受精卵中，得到F0代基因工程小鼠，如圖2。進一步將Stk24、Stk25基因敲除小鼠進行雜交，得到兩種基因同步敲除的小鼠。

圖1 Stk24以及Stk25打靶基因載體構(gòu)建示意圖Fig 1 Construction of vector of Stk24 and Stk25 target gene

圖2 顯微注射原理圖Fig 2 Schematic diagram of microinjection

1.3.2 小鼠基因型鑒定 以剪掉小鼠腳趾的方式進行編號，隨后對小鼠基因型進一步鑒定。將小鼠組織塊放入對應編號的1.5 mL EP管內(nèi)，加入75 μL鼠尾裂解液，離心，確保小鼠組織塊已沉入管底，95℃水浴30 min后加入75 μL中和液。隨后取2 μL作為DNA模板進行PCR擴增，反應體系以及PCR程序設定如下。反應體系為2 μL DNA模板，正向反向引物各0.5 μL，水3 μL，GOtaq mix 5 μL。PCR儀反應程序如下：預變性：94℃，5 min；變性：94℃，30 s；退火：60℃，30 s；延伸：72℃，40 s。變性，退火，延伸為32個循環(huán)；延伸：72℃，10 min。擴增產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠進行凝膠電泳，根據(jù)條帶長度來鑒定小鼠基因型。鑒定引物詳見表1。

表1 小鼠基因型鑒定引物序列Tab 1 DNA identification primer sequences of mice

1.3.3 出生后小鼠誘導基因敲除 在幼鼠出生后第2天使用4-羥基他莫昔芬誘導，確保喂養(yǎng)良好，小鼠幼崽采用側(cè)臥位，左手抓取，暴露出白色奶水充盈的胃部。此時使用1 mL胰島素注射器經(jīng)小鼠胃部注射，快速進針，深度約為0.5 cm，劑量為0.025 mg/g。停留30 s左右，慢慢將針移出，用酒精擦去少量溢出的液體，將注射完畢后的小鼠放入母鼠身邊，并向籠內(nèi)加入瓜子安撫母鼠。于出生后第6天檢測目的基因誘導敲除情況。

1.3.4 分離小鼠腦血管內(nèi)皮細胞 將小鼠麻醉后，充分暴露下腔靜脈以及心腔，剪斷下腔靜脈的同時從左心室緩緩注入PBS溶液充分灌流，盡量沖走組織內(nèi)循環(huán)的血液。剖開小鼠顱骨，將小腦剪碎研磨，并加入配置好的膠原酶Ⅳ在37℃水浴使組織充分消化，離心重懸過70 μmol/L篩，重懸后與血管內(nèi)皮特異性磁珠在4℃進行孵育，利用磁珠的特異性結(jié)合作用篩選出小鼠小腦血管內(nèi)皮細胞。選擇將兩對對照組小鼠和兩對基因敲除小鼠的小腦內(nèi)皮細胞合并。以上實驗共重復5次，產(chǎn)生5組實驗數(shù)據(jù)。

1.3.5 RNA提取 加入Ttizol迅速裂解組織后，靜置使細胞充分裂解，加入氯仿，震蕩離心后將試管45°傾斜取上清，加入異丙醇混勻孵育后離心，棄掉上清，使用75%乙醇清洗沉淀，離心后，晾干加入適量水溶解。

1.3.6 mRNA水平檢測 得到小腦血管內(nèi)皮細胞RNA后，測定RNA濃度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒經(jīng)PCR儀逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，隨后進行RT-qPCR，對mRNA表達水平進行分析。引物信息見表2。

表2 RT-qPCR引物Tab 2 RT-qPCR primer sequences

1.5 統(tǒng)計學處理RT-qPCR結(jié)果采用Graph Prism軟件進行分析。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正態(tài)分布，并采用非配對t檢驗來確定統(tǒng)計學意義。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果 通過PCR檢測loxp位點，Stk24野生型條帶位置在200 bp，目的條帶在250 bp。Stk25野生型條帶位置在300 bp，目的條帶在400 bp。Cdh5cre位點為500 bp的陽性條帶。因此使用Cdh5cre+/Stk24fl/+/Stk25fl/+雄鼠與Stk24fl/fl/Stk25fl/fl雌鼠雜交，可以初步得到Cdh5cre+/Stk24fl/+/Stk25fl/fl目的小鼠。下一步利用Cdh5cre+/Stk24fl/+/Stk25fl/fl與Stk24fl/fl/Stk25fl/fl進一步雜交，可得到Cdh5cre+/Stk24fl/fl/Stk25fl/fl，見圖3。

圖3 Stk24、Stk25條件性敲除小鼠基因型鑒定電泳圖Fig 3 Electrophoretogram for genotyping of Stk24 and Stk25 conditional knockout mice

2.2 轉(zhuǎn)錄水平驗證Stk24、Stk25基因敲除 通過對5組實驗結(jié)果的統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，分別與對照組相比，誘導后血管內(nèi)皮特異性敲除小鼠Stk24和Stk25的敲除效率分別為27%（t=2.84，P=0.0207）和30%（t=17.21，P<0.001），而同為GCKⅢ蛋白家族的Mst4基因表達量差異沒有統(tǒng)計學意義。見圖4。

圖4 小鼠小腦血管內(nèi)皮細胞中相關(guān)基因mRNA表達情況Fig 4 Relative mRNA expression in endothelial cells of cerebellum in mice

3 討論

CCM是一種顯性遺傳疾病，患者首發(fā)癥狀通常為癲癇、頭痛、反復發(fā)作的腦出血，嚴重影響患者生活質(zhì)量[6]。近年來，隨著對海綿狀畸形疾病研究逐漸明朗，研究者發(fā)現(xiàn)其致病基因主要由CCM1、CCM2、CCM3基因構(gòu)成，一般情況下3種基因形成一個完整的復合體，進而對下游絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MEKK）3通路起到抑制作用[7-8]。一旦其中基因發(fā)生突變，對MEKK3的抑制作用消失，轉(zhuǎn)而激活MEKK3及其下游基因，使正常血管形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)靜脈瘤樣病理表現(xiàn)[9]。

有研究報道，CCM3可與Sterile-20樣激酶的GCKⅢ亞家族成員結(jié)合，在果蠅模型中，GCKⅢ和CCM3基因的缺失對果蠅氣管發(fā)育具有相同的影響[10]。先前研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚模型中敲除Stk24和Stk25也同樣導致斑馬魚心臟變大，心包積液等嚴重心臟表型，與CCM基因敲除后的表型基本一致[11]。為進一步驗證GCKⅢ蛋白家族Stk24和Stk25在哺乳動物體內(nèi)的作用，筆者利用基因打靶技術(shù)構(gòu)建了Stk24/Stk25雙基因敲除小鼠模型。基因敲除小鼠作為疾病研究的重要模型動物，可模擬疾病的發(fā)生、發(fā)展，在疾病的機制研究中起重要作用。因此構(gòu)建血管內(nèi)皮特異性Stk24和Stk25雙基因敲除小鼠，對CCM致病通路以及血管發(fā)育的研究起到至關(guān)重要的作用。本研究成功繁育出目的基因敲除小鼠，并對其進行基因型鑒定以及mRNA水平敲除效率驗證，確認成功構(gòu)建出血管內(nèi)皮細胞特異性Stk24/Stk25敲除小鼠。通過對基因敲除小鼠的生長繁殖情況進行觀察，筆者發(fā)現(xiàn)其與野生型小鼠具有相同的繁殖能力，并且子代狀態(tài)良好。綜上，本研究通過基因打靶技術(shù)成功構(gòu)建了Stk24/Stk25雙基因敲除小鼠，為進一步研究海綿狀腦血管畸形致病機制以及相關(guān)藥物篩選提供了較好的動物模型。