宋軍，林曹瑞，賈璐璐，韓剛，尹海芳

（1.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞生物學系，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學醫(yī)學技術學院臨床生物化學教研室，天津 300203）

杜興肌肉萎縮癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種伴X染色體隱性遺傳的致死性疾病，在新生男孩中發(fā)病率為1/3 500，是兒童最常見的肌肉萎縮癥[1]?；颊呒∪饧毎乐厥軗p，最終因膈肌或心肌纖維化或壞死而過早死亡[2-4]。

糖皮質激素是目前臨床上針對DMD治療使用最為廣泛的一種藥物，但由于該藥物不能從根本上恢復dystrophin蛋白的表達，因此治療效果十分有限[5-6]；并且該激素藥物普遍存在生長抑制等多種不良反應，使DMD的治療仍具有重大挑戰(zhàn)[7]。Eteplirsen是一種磷酸二胺嗎啉代寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligonuclcotides，PMO），也是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）最早批準的用來治療DMD的藥物[8-9]。但eteplirseen在臨床使用時出現(xiàn)治療效果有限等問題，表明該治療方法還需要更多的研究來改進和完善，因此尋找一種安全的小分子藥物能夠使PMO在較低劑量下，有效提高外顯子跳讀效率以及肌肉組織中dystrophin蛋白的表達，被認為具有巨大的臨床價值。同時有報道稱，6-thioguanine[10]、Dantrolene[11]等一些化學藥物能夠提高DMD模型鼠PMO的跳讀效果，對PMO在DMD的治療中起到顯著的促進作用；并且本課題組前期發(fā)現(xiàn)，己糖和氨基酸等一些營養(yǎng)物也能夠對DMD的外顯子跳讀療法有明顯的促進作用[12-13]；而B族維生素作為人體內正常生命活動所必須的輔酶，是機體所必須的營養(yǎng)物質[14]。為探究其是否能夠作為輔劑來增強PMO的治療效果，筆者在DMD模型mdx小鼠開展篩選和系統(tǒng)測試。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 所有維生素藥物購自Sigma公司，O.C.T冷凍包埋劑購自Sakura公司，Bradford試劑購自上海生工公司，dystrophin抗體購自Abcam公司，伊紅和蘇木素染色試劑購自北京中杉金橋公司，山羊血清（NGS）和胎牛血清（FBS）購于Invitrogen公司，含DAPI熒光封片劑購自北京中杉金橋公司。SPF級C57BL/6小鼠購自北京維通利華公司[合格證號：1112511911004196；許可證號：SCXK（京）2017-0005]；mdx小鼠自行繁殖于天津醫(yī)科大學動物中心SPF級實驗室。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及給藥 對于局部注射實驗，27只同年齡的mdx小鼠通過簡單隨機抽樣分成9組：PMO生理鹽水組和PMO聯(lián)合8種維生素實驗組，每組3只，2 μg的PMO添加到生理鹽水或其他維生素溶液（5%）中，制成40 μL體積的注射液，注射到各組mdx小鼠的脛骨前肌中，2周后收樣，Saline表示PMO生理鹽水組，其他為不同維生素與PMO混合治療的實驗組。對于系統(tǒng)注射實驗，6只同年齡的mdx小鼠通過簡單隨機抽樣分成兩組：PMO生理鹽水組和PMO聯(lián)合維生素B12組，每組3只，將PMO劑量改成25 mg/kg添加到生理鹽水和5% B12溶液中，制成120 μL體積的注射液通過尾靜脈進行注射，每周1次，注射3次，最后1次注射后2周收樣。PMO-S組表示PMO生理鹽水組，PMO-B12表示PMO與維生素B12混合治療的實驗組，C57表示野生型的陽性對照，mdx組表示不給藥的空白對照，且所有實驗的C57和mdx小鼠都是年齡匹配的小鼠。

1.2.2 組織蛋白提取和濃度測定 動物處死后取出肌肉組織，用O.C.T包埋放入液氮冰凍，用冷凍切片機切成組織碎片收集到EP管中，加入90 μL組織裂解液（95%lysis buffer+5%β-mercaptoethanol）在冰上裂解30 min，隨后13 000×g（r=40 cm）離心10 min，取上清即為蛋白樣品。蛋白濃度測定使用Bradford法進行測定，取稀釋100倍的蛋白樣品和5個不同濃度梯度的蛋白標準品與250 μL的Bradford溶液混合，用酶標儀測量各溶液在595 nm處的吸光值，通過標準曲線法計算出不同樣品的蛋白濃度。

1.2.3 Western印跡檢測特異性蛋白表達水平 配制濃度為6%的SDS-PAGE凝膠，實驗組以及陰性對照mdx組的每個蛋白樣品取50 μg進行上樣，陽性對照C57組根據(jù)標注的百分比乘以50 μg進行不同量的上樣（2% C57即上樣1 μg、5% C57即上樣2.5 μg、6%C57即上樣3 μg、8%C57即上樣4 μg、10% C57即上樣5 μg），80 V恒壓下電泳30 min后調至120 V恒壓電泳3 h，通過110 mA的恒流過夜將凝膠上的蛋白轉到PVDF膜上，隨后用5%脫脂牛奶封閉4 h，加入一抗孵育過夜，再用牛奶洗3次，每次10 min，立即用二抗進行孵育，再用PBST洗3次，每次15 min，洗完后加上發(fā)光液（A液：B液=1:1），在暗室進行壓片曝光。每個樣品中dystrophin蛋白表達水平通過Image J軟件得出灰度值與對照的百分比C57樣品灰度值進行對比定量，計算出樣品中dystrophin蛋白的含量。

1.2.4 組織中dystrophin蛋白免疫熒光染色 選擇冷凍切片機切出厚度為8 μm的組織切片，放室溫平衡，隨后用油性筆圈出組織在玻片上的范圍，放入干凈的PBS中浸泡10 min，取出滴入封閉液（20% NGS、20%FBS和60%PBS）室溫封閉1.5 h，去除封閉液后滴加dystrophin一抗，室溫孵育1.5 h，PBS洗3次，滴加熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS洗3次后滴加含有DAPI的封片劑封片并避光晾干。

1.2.5 肌肉組織HE染色 選擇冷凍切片機切出的8 μm厚的組織切片，放室溫平衡，隨后放入干凈的PBS中浸泡10 min，取出進行梯度水化（無水乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇各浸泡5 min），浸入蒸餾水15 s，取出浸泡到蘇木素染液中13 min，用蒸餾水洗去玻片背景，浸入伊紅染液染色1 min，同樣用蒸餾水洗去背景后進行梯度脫水（70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→無水乙醇分別15 s、30 s、1 min、3 min），隨后浸入二甲苯中通透5～10 min，最后用中性樹脂進行封片。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用Adobe photoshop、Adobe illustrator和Image J軟件對圖片和數(shù)據(jù)進行處理和分析，使用SPSS20.0進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)通過±s表示，各組間比較采用t檢驗進行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光染色檢測B族維生素局部篩選情況 首先通過組織免疫熒光染色檢測肌肉組織中dystrophin陽性肌纖維的數(shù)量和分布情況，結果顯示：與PMO生理鹽水組相比，PMO與維生素B2、B3、D-Panthenol、B9和B12混合能顯著提高dystrophin陽性肌纖維的恢復數(shù)量（圖1A），其中維生素B12混合治療組dystrophin陽性肌纖維數(shù)量最多，達到了49.3%（t=8.015，P＜0.01，圖1B）。

圖1 免疫熒光染色檢測不同維生素與PMO在mdx小鼠上的局部篩選情況（100×）Fig 1 Local screen of vitamins with PMO in mdx mice by immunofluorescence（100×）

2.2 Western印跡檢測B族維生素局部篩選情況PMO與維生素B2、B3、D-Panthenol和B12混合能顯著提高dystrophin蛋白的表達水平（圖2A），通過計算各組灰度值與對應的2% C57（1 μg）、5%C57（2.5 μg）、8% C57（4 μg）、10% C57（5 μg）灰度值對比定量，結果顯示，維生素B12混合治療組表達水平最高，達到了10.5%（t=5.207，P＜0.05，圖2B）。

圖2 Western印跡檢測不同維生素與PMO在mdx小鼠上的局部篩選情況Fig 2 Local screen of vitamins with PMO in mdx mice by Western blotting

2.3 免疫熒光染色檢測維生素B12對PMO系統(tǒng)的促進作用 相比于PMO生理鹽水組B12治療組脛骨前肌和股四頭肌組織中dystrophin陽性肌纖維數(shù)量明顯增多（圖3）。

圖3 免疫熒光染色檢測維生素B12與PMO在mdx小鼠上的系統(tǒng)治療情況（100×）Fig 3 Systemic evaluation of vitamin B12 and PMO in mdx mice by immunofluorescence（100×）

2.4 Western印跡檢測維生素B12對PMO系統(tǒng)促進作用 同樣選擇小鼠肌肉組織蛋白檢測dystrophin蛋白表達水平，結果顯示，B12治療后蛋白表達水平有所提高（圖4A），而通過計算各組灰度值與對應的2% C57（1 μg）、5% C57（2.5 μg）、6% C57（3 μg）、10% C57（5 μg）灰度值對比定量，結果發(fā)現(xiàn)輔助添加B12聯(lián)合治療后脛骨前肌（t=9.631，P＜0.01）和股四頭肌（t=8.452，P＜0.01）dystrophin蛋白表達水平得到了顯著的提高（圖4B）。

圖4 Western印跡檢測維生素B12與PMO在mdx小鼠上的系統(tǒng)治療情況Fig 4 Systemic evaluation of vitamin B12 and PMO in mdx mice by Western blotting

2.5 PMO-B12對mdx小鼠肌肉病理的影響PMOB12聯(lián)合治療組沒有出現(xiàn)肌肉的不良反應（圖5）。

圖5 維生素B12與PMO在mdx小鼠上的系統(tǒng)治療病理檢測（100×）Fig 5 Muscle pathology of mdx mice treated with vitamin B12 and PMO systemically（100×）

3 討論

DMD是一種常見的遺傳性肌肉萎縮癥，患病兒童在少年時便開始發(fā)病，并隨著年齡增加，癥狀不斷加重，到青少年時便失去獨自行動能力，最終由于膈肌或心肌病變導致呼吸衰竭或心臟功能受損而過早死亡，患者平均壽命只有21歲[1，15]。而本研究所使用的DMD模型小鼠mdx是其dystrophin基因外顯子23發(fā)生點突變，形成終止密碼子，使蛋白不能正常表達，與疾病的發(fā)病機制相同，因此這種模型小鼠在一定程度上很好的體現(xiàn)了DMD的一些病癥[16-17]。

近年來關于DMD的治療也取得了一定的進展，F(xiàn)DA批準上市了多款外顯子跳讀療法的反義寡核苷酸藥物[18-19]。盡管如此，但在臨床使用時發(fā)現(xiàn)核酸藥物存在著難以解決的如用藥量大、靶向性差及系統(tǒng)運輸效率低等問題，前期的報道稱Dantrolene[11]、己糖GF[12，20]以及glycine等[13]小分子分別通過影響剪接頻率、能量供給以及組織新生角度去促進反義寡核苷酸藥物引起的外顯子跳讀，都取得了較好的治療效果，但現(xiàn)有的這些小分子輔劑對DMD患者心臟功能的改善效果非常有限。因此筆者通過動物模型對生活中常見的營養(yǎng)分子維生素進行篩選。

本研究首先在局部篩選過程中使用PMO與不同維生素混合進行治療，以單獨的PMO治療效果為基準，評價維生素帶來的促進效果，結果發(fā)現(xiàn)，維生素B12能將dystrophin蛋白恢復水平從5%作用提高到接近12%，展現(xiàn)出了巨大的潛力。在隨后的系統(tǒng)治療中，維生素B12作為營養(yǎng)補充劑單獨治療并不能顯示出對dystrophin蛋白的恢復，這與6-thiog uanine[10]和glycine等[13]小分子輔劑類似，因此在系統(tǒng)治療中未設置單獨維生素B12實驗組，但通過與PMO生理鹽水組進行比較，發(fā)現(xiàn)維生素B12聯(lián)合治療能夠顯著提高PMO在脛骨前肌和股四頭肌上的治療效果，但治療效果主要體現(xiàn)在占比較大的骨骼肌上面，推測維生素B12在通過尾靜脈注射進入循環(huán)系統(tǒng)后，很快隨血流進行全身系統(tǒng)的分布，但由于脂溶性較差很難在組織內部進行停留，快速被機體清除出去[21-22]。因此針對占比較大的骨骼肌更能受到維生素帶來的影響，這也導致PMO的治療效果在大多數(shù)的肌肉組織非常有限，因此后續(xù)改變維生素B12的給藥途徑，例如口服給藥或者給藥頻率改成每日補充，可能會顯著提高維生素B12的治療效果。同時通過HE染色檢測肌肉組織病理情況發(fā)現(xiàn)，維生素PMO-B12聯(lián)合治療在提高原有的PMO治療效果的同時，并未檢測到肌肉的損傷，推測是由于水溶性維生素不會在體內進行蓄積，會被快速清除，因此避免了因為頻繁給藥而帶來一定的不良反應在后續(xù)研究中，將會在mdx小鼠上對PMO聯(lián)合維生素B12進行一個長期的系統(tǒng)治療，進一步探究維生素B12對PMO治療的促進作用，為DMD的臨床治療提供新的治療手段。