孫丹晨，王志慧，喬衛(wèi)

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，天津 300070）

抑郁癥是一種以情緒低落、自我價值感降低、快感缺失為主要癥狀的精神類疾病[1]，多伴有失眠癥狀，嚴(yán)重時有自殘或自殺傾向，已成為嚴(yán)重威脅人類身心健康的世界性疾病。目前對抑郁癥的治療主要以西藥為主，但是西藥存在不良反應(yīng)多、耐藥性及過敏性等問題，所以對相關(guān)中藥的研究日益迫切。

酸棗仁為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，是臨床治療失眠癥、抑郁癥、焦慮癥的常用中藥[2]，含有皂苷、黃酮、脂肪酸、生物堿等化學(xué)成分[3]。有研究表明，酸棗仁生物堿具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁的作用[4]。酸棗仁生物堿所含化學(xué)成分類型多樣，且通過多目標(biāo)、多渠道、多層次綜合調(diào)控發(fā)揮藥效[5]。因此復(fù)雜的靶點和機制是研究的難點。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥的研究和開發(fā)領(lǐng)域，為研究中醫(yī)藥與靶點疾病的關(guān)系提供了新的契機[6]。故本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選酸棗仁生物堿治療抑郁癥的有效成分，并且對成分發(fā)揮作用的潛在靶點與信號通路進(jìn)行整合與分析，初步闡明其抗抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）；TCMDatabase@Taiwan（http://tcm.cmu.edu.tw/）；Pubmed（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）；Pharm Mapper Server（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/）；UniProtDatabase（http：//www.uniprot.org/）；Drug Bank Database（http：//www.drugbank.ca/，Version 4.3）；DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）；美國化學(xué)文摘數(shù)據(jù)庫（Chemical Abstract Service，CAS）；Chem Bio Draw Ultra 12.0；Cytoscape3.4.0。

1.2 酸棗仁生物堿主要成分收集 通過檢索TCMSP、TCMDatabase@Taiwan、Pubmed、CAS等數(shù)據(jù)庫收集酸棗仁生物堿成分。

1.3 主要成分抗抑郁潛在作用靶點的反向預(yù)測及篩選 根據(jù)已知18個酸棗仁生物堿成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，利用Chem Bio Draw Ultra 12.0軟件畫出化學(xué)結(jié)構(gòu)，并以（*sdf）格式保存，將文件上傳Pharm Mapper Server，靶點蛋白種類選擇為Human Protein Targets，每個中藥成分將得到300個潛在抗抑郁的作用靶點[7]。然后在UniProt數(shù)據(jù)庫中篩選作用靶點物種為人，并將名稱校正為官方名稱[8]，可以獲得該靶點的基因、功效等相關(guān)信息。在Drug Bank數(shù)據(jù)庫中檢索目標(biāo)靶點，并與美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的小分子抗抑郁藥靶點對比。應(yīng)用Cytoscape3.4.0篩選各靶點的Degree大于8的靶蛋白，用于生物網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

1.4 抗抑郁靶點KEGG及GO分析 將Pharm Map－per Server中返回的與抑郁相關(guān)的潛在靶點上傳到DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。KEGG整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息，靶點蛋白直接反映到靶點通路上，藥物靶向富集途徑一般被認(rèn)為是藥物調(diào)節(jié)的途徑和藥物發(fā)揮療效的機制。通過GO富集分析，獲得靶標(biāo)的生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）富集項，并預(yù)測靶標(biāo)的功能分布。

1.5 生物網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建Cytoscape3.4.0是一款開放源碼的圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析和編輯的生物咨詢軟件，可將基因表達(dá)信息、靶點通路疾病相關(guān)功能注釋整合進(jìn)網(wǎng)絡(luò)中，觀察彼此之間的關(guān)聯(lián)性[9]。每個節(jié)點（Node）分別代表成分、靶點、通路，節(jié)點與節(jié)點之間的連接即為邊（Edge）代表各節(jié)點之間的相互作用。通過綜合衡量3個指標(biāo)即網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度（Degree）、中介中心性（Node betweenness）、接近中心性（Closeness）去評估網(wǎng)絡(luò)圖中每個節(jié)點的顯著性。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度、中介中心性、接近中心性值越大，揭示其在網(wǎng)絡(luò)中的顯著性越高。

2 結(jié)果

2.1 酸棗仁生物堿主要成分 通過檢索化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)收集并篩選酸棗仁生物堿成分，最終獲得18個成分。具體化學(xué)信息如表1所示。

表1 酸棗仁生物堿成分的化學(xué)信息Tab 1 Chemical information of alkaloid constituents of ZSS

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

2.2 主要成分抗抑郁潛在作用靶點 將Pharm Mapper Server返回的作用靶點與Drug Bank中FDA批準(zhǔn)的小分子抗抑郁藥物靶點比對分析，篩選出15個抗抑郁相關(guān)潛在靶點（見表2）以及10個相關(guān)具有抗抑郁作用的活性生物堿成分（N-甲基巴婆堿、酸李堿、木蘭花堿、荷葉堿、異紫堇定堿、原荷葉堿、烏藥堿、觀音蓮明堿、鵝掌楸葉堿、酸棗仁環(huán)肽）。

表2 酸棗仁生物堿成分抗抑郁潛在靶點信息Tab 2 Information on potential antidepressant targets of alkaloid constituents in ZSS

2.3 潛在抗抑郁靶點KEGG通路 酸棗仁生物堿成分治療抑郁癥的15個潛在靶點共涉及131條相關(guān)信號通路。表3及圖1列舉出頻率較高的8條相關(guān)信號通路。其中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路、鈣離子信號通路是最主要的靶點通路。

表3 酸棗仁生物堿抗抑郁潛在靶點KEGG通路注釋分析結(jié)果Tab 3 KEGG pathway annotation analysis of potential antidepressant target of alkaloids in ZSS

圖1 酸棗仁生物堿抗抑郁潛在靶點KEGG通路注釋分析結(jié)果Fig 1 KEGG pathway annotation analysis of potential antidepressant target of alkaloids in ZSS

2.4 GO富集分析結(jié)果 對酸棗仁生物堿的15個潛在抗抑郁靶點進(jìn)行GO富集分析。分析結(jié)果可以用來研究靶標(biāo)的功能分布，靶標(biāo)的功能分布分別由3部分組成：生物過程、分子功能和細(xì)胞成分，如圖2所示。分析氣泡圖可知，15個潛在抑郁靶點涉及17種生物進(jìn)程，6個細(xì)胞組分以及13種分子功能（q<0.01，q<0.05，q<0.05）。RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、GTPase活性的正調(diào)控、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)是潛在靶點參與的主要生物過程。在分子功能分析中，蛋白連接和Ras鳥苷-核苷酸交換因子活性是非常重要的；等離子體膜與細(xì)胞核是潛在靶點涉及的主要細(xì)胞成分。

圖2 酸棗仁生物堿抗抑郁潛在靶點GO通路注釋分析結(jié)果Fig 2 GO annotation analysis of potential antidepressant target of alkaloids in ZSS

2.5 生物網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 如圖3所示，酸棗仁生物堿抗抑郁失眠的“成分-靶點-信號通路”生物網(wǎng)絡(luò)圖由156個節(jié)點（10個成分、15個靶點及131條信號通路）和259條邊構(gòu)成。不同顏色的節(jié)點分別代表酸棗仁生物堿中抗抑郁失眠的活性成分、潛在靶點及調(diào)控通路，邊代表三者之間的相互作用。節(jié)點的大小代表每個節(jié)點的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度（Degree），度中心性越高節(jié)點就越大，越能顯示出該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)圖中的重要性。分析網(wǎng)絡(luò)圖可知，酸棗仁生物堿成分荷葉堿、原荷葉堿、右旋衡州烏藥堿、木蘭花堿在“成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度較高，可能是治療抑郁癥的重要成分；預(yù)測獲得的15個作用靶點中P0DP23、P00533、P49841、P19793等靶點基因可能是酸棗仁生物堿治療抑郁癥的主要靶點；PI3K-Akt信號通路、鈣離子信號通路等可能是酸棗仁生物堿治療抑郁癥涉及的主要通路。

圖3 酸棗仁生物堿抗抑郁“成分-靶點-通路”生物網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Antidepressant'component-target-pathway'biological network diagram of alkaloids in ZSS

3 討論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以抑郁癥為目的疾病，篩選酸棗仁生物堿中具有抗抑郁的活性成分、作用靶點及相關(guān)通路。通過分析生物網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，酸棗仁生物堿中有10個成分可能具有抗抑郁效果，其中荷葉堿、原荷葉堿、右旋衡州烏藥堿、木蘭花堿等成分對應(yīng)的相關(guān)靶點個數(shù)較多，說明這些成分可能是酸棗仁生物堿發(fā)揮作用的重要成分，為確認(rèn)酸棗仁生物堿抗抑郁有效成分提供了理論依據(jù)。

預(yù)測獲得的15個作用靶點中P0DP23、P00533、P49841、P19793等靶點基因可能是酸棗仁生物堿治療抑郁癥的主要靶點。P0DP23是一種鈣調(diào)蛋白（CALM1）。鈣離子能在細(xì)胞內(nèi)傳遞神經(jīng)信號，廣泛參與機體各種生理功能的調(diào)節(jié)[10]。P00533稱為表皮生長因子受體（EGFR），是一種多功能跨膜糖蛋白，其配體可介導(dǎo)酪氨酸激酶活性。少量表皮生長因子（EGF）可使細(xì)胞分裂生長，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)密切相關(guān)。有研究表明，正常生理功能哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中EGF和EGFR的表達(dá)很低，但在CNS損傷后第7天，EGF和EGFR的表達(dá)顯著增加，28 d后逐漸下降到正常水平[11]。據(jù)報道，磷酸化的EGFR和MAPK信號通路與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化具有協(xié)同作用[12]。P49841稱為糖原合酶激酶-3β（GSK3B），是磷酸化后完全失活的激酶之一[13]。近年來越來越多的研究表明，GSK3B在抑郁癥的發(fā)病和治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。例如：與正常人相比，在重度抑郁癥死亡患者大腦皮質(zhì)中GSK3B的活性顯著升高[14]；持續(xù)刺激GSK3B（KI小鼠），氟西汀的促神經(jīng)元再生及抗抑郁作用都會被消除[15]；選擇性抑制GSK3B可導(dǎo)致動物產(chǎn)生抗抑郁作用等。P19793稱為視黃酸受體（RXR-α），視黃酸通過視黃酸受體影響下丘腦促皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）神經(jīng)元的活性、控制CRF的表達(dá)，導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的功能異常，進(jìn)而推測視黃酸信號系統(tǒng)對下丘腦CRF神經(jīng)元的調(diào)節(jié)可能是抑郁癥發(fā)病的一種新機制。研究發(fā)現(xiàn)，在給予成年大鼠少量的RXR-α選擇性拮抗劑，可以縮短其在強迫游泳行為學(xué)檢測中的不動時間，提示視黃酸可能通過RXR-α干預(yù)海馬神經(jīng)元活性和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)等，從而控制下丘腦CRF的表達(dá)和HPA軸活性，進(jìn)而參與抑郁發(fā)病過程[16]。

研究表明，PI3K-Akt信號通路參與了微血管損傷和血管生成，在抑郁癥的發(fā)生中扮演重要角色[17]。有研究顯示氟西汀可以使海馬的Akt1表達(dá)增加，促進(jìn)Akt磷酸化，從而加速血管的生成，促進(jìn)海馬血液循環(huán)，都有助于抑郁癥的治療[18]。鈣離子信號通路與抑郁癥關(guān)系密切，是治療抑郁的重要機制之一。其作為一種鈣受體蛋白，廣泛存在于腦組織神經(jīng)元中，在神經(jīng)元的應(yīng)激和修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用。氟西汀和SNRIS可以激活大鼠前額葉皮質(zhì)中的鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ（CaMKⅣ）。而CaMKⅣ抑制劑可在體外阻斷cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的磷酸化[19]。

本研究最終預(yù)測獲得酸棗仁生物堿抗抑郁的生物網(wǎng)絡(luò)圖，從整體角度分析酸棗仁總生物堿的抗抑郁成分、主要靶點和通路。綜上所述，酸棗仁生物堿中抗抑郁成分荷葉堿、原荷葉堿、右旋衡州烏藥堿、木蘭花堿主要通過影響神經(jīng)信號傳遞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)、HPA軸活性、PI3K-Akt通路活化以及MAPK反應(yīng)級聯(lián)等發(fā)揮抗抑郁作用，本研究為下一步抗抑郁活性成分分離及活性評價實驗奠定了理論基礎(chǔ)。