胡燕珍，黃 斌，張媛媛，陳 樂，吳先昊，虞金寶

（江西省中醫(yī)藥研究院，江西 南昌 330046）

烏蕨Stenoloma chusanum(Linn.) Ching為鱗始蕨科烏蕨屬多年生草本植物，又稱烏韭、大葉金花草、野雞尾、金花草等[1]，生于林下或灌叢中濕地，廣泛分布于長江以南各地，且北達(dá)陜西南部[2]，是一種民間常用中草藥，具有清熱解毒、活血利濕、止血生肌之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，烏蕨藥理作用廣泛、藥用價(jià)值高，具有抗菌、抗炎、保肝、抗腫瘤、降血糖等多種生物活性[3-5]。烏蕨中含有大量黃酮類、酚酸類及揮發(fā)油等化學(xué)成分[6]。其地上部分總黃酮含量高達(dá)30%以上[7]，該類成分具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基能力，可有效抑制脂質(zhì)過氧化，其抗氧化能力與烏蕨中總黃酮含量呈正相關(guān)[8]；其中黃酮類成分牡荊苷對食管癌細(xì)胞特別是EC-109細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[8]。而酚酸類化合物的藥理活性也較廣泛，具有抗菌、消炎、抗病毒 、抗氧化、降血脂、抗凝血等作用[9]，其中原兒茶酸、原兒茶醛具有明顯的抗菌活性[10]、抗炎[11]、抗蛋白纖維化[12]、抗氧化應(yīng)激[13]等作用。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前多以牡荊苷、原兒茶酸、原兒茶醛等單一或單一類成分含量來控制烏蕨藥材的質(zhì)量[14-15]。由于中藥成分的復(fù)雜性及藥理作用的多樣性，而以單個(gè)或單一類指標(biāo)成分的含量來評價(jià)藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，未能真實(shí)、全面地反映出藥材的內(nèi)在質(zhì)量?；诖耍狙芯坎捎肏PLC技術(shù)，建立同時(shí)測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷三種指標(biāo)性成分含量的方法，以期為后續(xù)烏蕨藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供可靠參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技 公 司）；Dikmatech Diamonsil Plus C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm； 柱 號(hào)：2509215，Dikma Technologies）；MS105Du型十萬分之一天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；103B型200 g高速中藥粉碎機(jī)（浙江省瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 材料

1.2.1 試藥 原兒茶酸（批號(hào)：110809-201906，純度：97.7%，中國食品藥品檢定研究院）；原兒茶醛（批號(hào)：110810-201608，純度：99.3%，中國食品藥品檢定研究院）；牡荊苷（批號(hào)：111687-201704，純度：94.9%，中國食品藥品檢定研究院）。乙腈和甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其它試劑均為分析純。

1.2.2 藥材 實(shí)驗(yàn)材料于2019年至2020年分別采集于江西各地，共計(jì)11個(gè)批次樣品，經(jīng)江西省中醫(yī)藥研究院虞金寶研究員鑒定為鱗始蕨科植物烏蕨Stenoloma chusanum(Linn.) Ching的全草，藥材來源信息，見表1。

表1 樣品信息Tab. 1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikmatech Diamonsil Plus C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫；檢測波長：260 nm（原兒茶酸、原兒茶醛）、340 nm（牡荊苷）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL，見表2。

表2 梯度洗脫程序Tab. 2 Gradient elution procedure

在該色譜條件下，樣品中3種活性成分（原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷）的峰與其它非被檢測峰能夠達(dá)到基線分離。理論塔板數(shù)按原兒茶酸峰計(jì)算不低于6 000，R>1.5?；旌蠈φ掌啡芤?、供試品溶液色譜圖，見圖 1。

圖1 混合對照品溶液（A、C）和供試品溶液（B、D）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed control（A/C）and sample（B/D）

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷對照品適量，加70%甲醇制成各成分對照品母液（原兒茶酸0.251 3 mg/mL 、原兒茶醛0.282 0 mg/mL、牡荊苷0.238 4 mg/mL）。再精密吸取原兒茶酸對照品母液2 mL、原兒茶醛對照品母液2 mL、牡荊苷對照品母液6 mL置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，即得原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷的混合對照品儲(chǔ)備溶液（質(zhì)量濃度分別為50.26 μg/mL、56.40 μg/mL、143.04 μg/mL）。

2.3 供試品溶液的制備

取各批次烏蕨藥材粉末（過三號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）60 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下各對照品母液，用70%甲醇逐步稀釋，得到系列混合對照品溶液。原兒茶酸濃度分別為50.26、40.21、15.08、12.06、9.05、5.026 μg/mL；原兒茶醛濃度分別為56.40、45.12、16.92、13.54、10.15、5.640 μg/mL；牡荊苷濃度分別為143.04、114.43、95.36、76.29、57.22、14.304 μg/mL。精密吸取上述各溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，以對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍，見表3。

表3 各成分線性回歸分析Tab. 3 Regression analysis of different components

2.5 精密度考察

精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄各成分峰面積，計(jì)算原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷峰面積的 RSD，分別為0.23%、0.28%、0.13%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：20200528，昌江區(qū)烏蕨）10 μL，分別于0、2、6、10、16、20、24 h進(jìn)樣測定，記錄各成分峰面積，計(jì)算原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷峰面積的 RSD，分別為0.69%、0.61%、0.68%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性考察

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：20200528，昌江區(qū)烏蕨）共6份，按“2.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定各成分含量，測得原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷平均含量分別為0.335 7 mg/g、0.406 4 mg/g、2.443 4 mg/g ，RSD分別為1.15%、1.25%、1.06%，表明該法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的烏蕨藥材粉末（批號(hào)：20200528，昌江區(qū)烏蕨）6份，各約0.5 g，精密稱定，分別精密加入含有原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷的混合對照品溶液（原兒茶酸6.760 8 μg/mL、原兒茶醛9.493 1 μg/mL、牡荊苷39.28 μg/mL）25 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定各成分含量，計(jì)算4種成分的加樣回收率及RSD，見表4。

表4 回收率結(jié)果（n = 6）Tab. 4 Results of recovery rate（ n = 6）

2.9 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地的烏蕨樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定各成分含量，計(jì)算3種成分的含量，見表5。從烏蕨樣品中3種成分含量測定結(jié)果可知，牡荊苷的含量最高（0.598 9～2.443 4 mg/g），而原兒茶酸、原兒茶醛受生長環(huán)境、采收期等影響，含量差異較明顯。以3種成分的含量及總含量為指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，由圖2可知，當(dāng)樣品含量分為4類時(shí)，渝水烏蕨（S2）單獨(dú)聚為一類，總含量最高（3.608 5 mg/g）；橫峰烏蕨（S5）單獨(dú)聚為一類，總含量最低（1.239 6 mg/g）；而浮梁烏蕨（S3）和昌江烏蕨（S4）聚為一類；其它各為一類，說明其3種成分總含量較接近。

圖2 11批烏蕨藥材樣品的聚類樹狀圖Fig.2 Cluster dendrogram of 11 batches of Stenoloma chusanum samples

表5 不同產(chǎn)地烏蕨含量測定結(jié)果（mg/g，n = 2）Tab. 5 Results of content determination of different origin of Stenoloma chusanum (mg/g，n = 2)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，本實(shí)驗(yàn)先后考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.4%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.4%磷酸水、乙腈-0.2%冰醋酸水等色譜條件對樣品中待測成分的分離情況，結(jié)果顯示有機(jī)相為乙腈時(shí)基線漂移較小且洗脫能力強(qiáng)；水相為0.4%磷酸水時(shí)，色譜峰分離效果好、峰形尖銳、對稱性良好且理論塔板數(shù)高。綜合分離情況、出峰時(shí)間、基線漂移程度、定量準(zhǔn)確度等因素，最終確定以乙腈-0.4%磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。在該色譜條件下，樣品分離度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可用于烏蕨藥材的質(zhì)量控制。

3.2 供試品提取條件的優(yōu)化

由于烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷三種成分的極性差異較大，故考察了不同濃度甲醇和乙醇對待測成分提取的效果。除此之外，提取方式、提取時(shí)間、提取溶劑量三者對藥材中有效成分的提取率影響也較大，因此本實(shí)驗(yàn)采用單因素考察法，以原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷的含量為檢測指標(biāo)，對提取溶劑（70%甲醇、100%甲醇、65%乙醇、95%乙醇）、提取方式（回流、超聲）、超聲提取時(shí)間（30、60、90 min）、提取溶劑量（15、25、50 mL）分別進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，樣品以70%甲醇超聲提取效率高于其它溶劑與方法。在超聲時(shí)間方面考察發(fā)現(xiàn)，待測成分提取率由大到小依次為：超聲90 min＞超聲60 min＞超聲30 min，但三者無顯著性差異，考慮到既節(jié)約能量又保證待測成分提取完全，最終選擇樣品超聲60 min為最佳提取時(shí)間。

3.3 檢測波長的選擇

采用HPLC-DAD檢測器分別對三種待測成分在190 ～ 400 nm波長處進(jìn)行全掃描，結(jié)果表明，原兒茶酸最大吸收波長為260 nm；原兒茶醛最大吸收波長為270 nm，但在260 nm處也有較大吸收；而牡荊苷在340 nm處有最大吸收，在此波長檢測下，樣品中牡荊苷響應(yīng)值高，圖譜基線平穩(wěn)且干擾峰少。考慮到待測成分間吸收波長差異較大，為確保3種成分均能得到較好的響應(yīng)，因此采用雙波長同時(shí)進(jìn)行檢測，以便能更準(zhǔn)確地對3種物質(zhì)含量進(jìn)行測定。

4 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷的HPLC雙波長分析方法。結(jié)果顯示，原兒茶酸等3個(gè)指標(biāo)成分之間含量差異較大，原兒茶酸最大值可達(dá)最小值的3倍，原兒茶醛最大值可達(dá)最小值的4.5倍，牡荊苷最大值可達(dá)最小值的4倍，其中11批樣品中又以牡荊苷含量最高，為0.598 9 ～2.443 4 mg/g。而導(dǎo)致各地烏蕨中活性成分含量差異大的原因，可能與植物自身遺傳多樣性、地理位置、生長環(huán)境、土壤、光照、氣溫、雨量等因素有關(guān)。該方法符合定量分析要求、操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，且在各成分適宜波長處分別測定其含量，可明顯提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。本法可作為烏蕨藥材含量測定方法，可為其質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。