朱道仙，陸 江，郝福星，吳 植，劉 莉

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院，江蘇泰州 225300；3.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300)

貓脂肪肝(Feline hepatic lipidosis，F(xiàn)HL)是貓最常見的肝膽疾病，如不進(jìn)行積極有效地治療,病死率可達(dá)90%以上，嚴(yán)重危害貓的健康與生命[1]。目前，該病的診斷主要依賴臨床癥狀特征、血液生化、影像學(xué)檢查及病理學(xué)檢測(cè)等[2-3]。這些方法還存在一定的局限性，如臨床癥狀及血液生化易于其他肝病混淆，B超檢查很難區(qū)分FHL與肥胖癥，病理學(xué)檢測(cè)具有創(chuàng)傷性易引發(fā)肝出血等缺點(diǎn)，容易造成漏診和誤診，降低了治療效果。雖然有些新的診斷方法報(bào)道[4-5]，但由于操作復(fù)雜或價(jià)格昂貴，未在臨床普及。因此，臨床上缺乏可靠的檢測(cè)手段來協(xié)助貓脂肪肝的診斷與預(yù)后。

β-羥丁酸(BHBA)是脂肪酸氧化產(chǎn)生的一種中間代謝產(chǎn)物，正常情況下能很快被分解利用，血液中含量很低，當(dāng)BHBA產(chǎn)生過量時(shí)可積聚于血液中，形成酮血癥[6]。有研究表明，BHBA與貓脂肪肝的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。本研究回顧性收集了大量貓脂肪肝的病例，旨在分析血清BHBA在貓脂肪肝中的表達(dá)情況及其相關(guān)性，為該病的診斷和預(yù)后提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 β-羥丁酸檢測(cè)試劑盒，寧波瑞源生物科技有限公司產(chǎn)品；血糖、總蛋白、三酰甘油、總膽固醇、總膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶及堿性磷酸酶等指標(biāo)檢測(cè)試劑，愛德士生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器設(shè)備 CatalystDx動(dòng)物生化分析儀，美國(guó)愛德士生物科技公司產(chǎn)品；DU8-M6全數(shù)字彩色B超儀，徐州市瑞華電子科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Multiskan GO酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 臨床樣本 樣本采自2017年1月至2019年12月在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院教學(xué)寵物醫(yī)院就診的患貓，根據(jù)癥狀學(xué)特征(黃疸、嘔吐及厭食)、血液生化指標(biāo)(肝功能異常)和肝臟B超檢查(肝內(nèi)回聲增強(qiáng))初診為貓脂肪肝的病例。然后，以超聲引導(dǎo)下細(xì)針抽吸肝細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)評(píng)估，以單位面積≥1/3肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性為金標(biāo)準(zhǔn)[8]，共收集37例脂肪肝患貓作為脂肪肝組。

同時(shí)，按年齡、性別及體重相近原則，選取同期就診有黃疸癥狀、肝功能指標(biāo)異常，但肝臟B超檢查未發(fā)現(xiàn)脂肪肝征象的患貓37例作為其他肝病組和健康體檢貓(未有任何臨床癥狀，血液生化指標(biāo)正常)37例作為健康對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法 所有樣本在就診當(dāng)天采集靜脈血5 mL，1 500 r/min離心10 min，分離出血清。采用全自動(dòng)血液生化分析儀檢測(cè)血清中血糖(Glu)、總蛋白(TP)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(Chol)及總膽紅素(TBIL)水平，同時(shí)檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及堿性磷酸酶(ALP)活性。血清β-羥丁酸(BHBA)用酶比色法測(cè)定，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 治療效果評(píng)價(jià) 收集所有脂肪肝患貓的治療資料，包括治愈情況、死亡情況、療程等。治愈判定標(biāo)準(zhǔn)為臨床癥狀消退，血液肝功能指標(biāo)正常，并計(jì)算治愈率=治愈數(shù)/總病例數(shù)×100%。

1.2.3 樣本量估算 本研究以受試者工作曲線(ROC曲線)下面積(AUC)為主要指標(biāo)估算樣本量。假設(shè)血清BHBA能有效區(qū)分脂肪肝患貓與非脂肪肝患貓，AUC>0.5。前期預(yù)試驗(yàn)獲知BHBA的AUC為0.7，顯著性水平α=0.05，β=0.1，假陽性率(false positive rate，F(xiàn)PR)取值范圍為0～1.0，組間比例1∶1，采用PASS 16.0軟件估算樣本量。結(jié)果表明，至少需要納入脂肪肝患貓33例，對(duì)照33例。而本研究納入患貓與兩組對(duì)照貓均為37例，滿足研究要求。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的連續(xù)型數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布連續(xù)型數(shù)據(jù)用中位數(shù)(最小值，最大值)表示。采用ANOVA單因素方差分析事后多重比較LSD進(jìn)行組間兩兩比較，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)比較組間差異，百分率比較采用卡方檢驗(yàn)，BHBA與其他指標(biāo)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。根據(jù)繪制受試者工作曲線(ROC)來判斷血清BHBA的診斷效能。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 血液生化指標(biāo)的變化

從表1可以看出，與健康對(duì)照組比較，脂肪肝組及其他肝病組的血清TP顯著降低，且低于參考范圍，血清TBIL、ALT、AST及ALP顯著升高(P<0.05)，且高于參考范圍。與其他肝病組比較，脂肪肝組血清TBIL及ALP升高顯著(P<0.05)。脂肪肝組血清Chol水平雖然顯著高于其他肝病組和健康對(duì)照組(P<0.05)，但還在參考范圍內(nèi)。

表1 各組血液生化指標(biāo)的比較

2.2 血清BHBA水平的變化

脂肪肝患貓血清BHBA水平為1.30 mmol/L±0.65 mmol/L，其他肝病患貓血清BHBA水平為0.47 mmol/L±0.22 mmol/L，健康貓血清BHBA水平為0.38 mmol/L±0.13 mmol/L，脂肪肝組患貓血清BHBA水平極顯著高于其他肝病組和健康對(duì)照組(P<0.01)，如圖1A所示。以參考值上限[10](0.5 mmol/L)為閾值，高于閾值定義為BHBA升高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪肝組的37例病例中有32例表現(xiàn)為BHBA升高，占比86.48%，極顯著高于其他肝病組(32.43%)和健康對(duì)照組(16.22%)P<0.01)，如圖1B所示。

2.3 脂肪肝組血清BHBA與肝功能生化指標(biāo)的相關(guān)性

將脂肪肝組患貓血清BHBA與ALT、AST、ALP及TBIL等指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BHBA與ALP呈現(xiàn)強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系(r=0.776,P<0.01，圖2C)，與ALT、TBIL呈中等正相關(guān)關(guān)系(r值分別為0.534、0.503，P<0.01，圖2A、圖2D)，與AST無相關(guān)性(r=0.141,P>0.05，圖2B)。

圖2 脂肪肝組血清BHBA與ALT、AST、ALP及TBIL等指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 血清BHBA在貓脂肪肝中的診斷效能

ROC曲線下面積(AUC)是反映診斷效能的一個(gè)重要指標(biāo)，AUC越大，診斷可靠性就越強(qiáng)。由圖3可知，BHBA的敏感度為94.6%，特異性為75.7%，截?cái)嘀禐?.828 mmol/L，AUC為0.923，P<0.01，說明血清BHBA對(duì)貓脂肪肝具有較好的診斷價(jià)值。

圖3 血清BHBA對(duì)貓脂肪肝的ROC曲線圖

F.脂肪肝組；L.其他肝病組；H.健康對(duì)照組

2.5 血清BHBA對(duì)貓脂肪肝治療結(jié)果的影響

以BHBA截?cái)嘀?.828 mmol/L為分割點(diǎn)，將37例脂肪肝患貓分成2組，BHBA<0.828 mmol/L組共12例，全部治愈，治愈率為100%，顯著高于BHBA≥0.828 mmol/L組的72.0%(P<0.05)，療程中位數(shù)為7.0 d，顯著低于BHBA≥0.828 mmol/L組的9.5 d(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表2 不同血清BHBA水平脂肪肝患貓治療效果的比較

3 討論

目前，F(xiàn)HL主要根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、血液生化、臨床病理結(jié)果和肝臟超聲表現(xiàn)進(jìn)行診斷。然而，病史、臨床表現(xiàn)和血液生化檢查對(duì)FHL診斷的特異性較差，其他潛在的疾病過程都可能造成混淆。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL患貓的病史及臨床表現(xiàn)與其他肝臟疾病相似，血液中ALT、AST及TBIL等肝功指標(biāo)雖然高于健康貓，但與患有其他肝病貓無差異，也說明目前這些診斷依據(jù)的特異性較差，容易誤診。肝臟超聲檢查可以提高FHL診斷，有研究表明由3名委員會(huì)認(rèn)證的放射科醫(yī)生進(jìn)行腹部超聲檢查，對(duì)FHL診斷的準(zhǔn)確率為70%[11-12]，也滿足不了臨床的需求，會(huì)出現(xiàn)漏診。最終診斷通常是通過細(xì)針抽吸肝細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)評(píng)估或通過肝活檢進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估來做出，存在創(chuàng)傷性，容易出現(xiàn)感染及出血等并發(fā)癥[13]。由此可見，尋找一種對(duì)FHL診斷具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的診斷標(biāo)志物十分重要。

負(fù)能量平衡被認(rèn)為是FHL發(fā)生的主要原因[14]。在負(fù)能量平衡狀態(tài)下，脂肪組織中大量的甘油三酯被動(dòng)員分解，產(chǎn)生的游離脂肪酸進(jìn)入肝臟，在線粒體中進(jìn)行β-氧化生成乙酰輔酶A，然后乙酰輔酶A可進(jìn)入三羧酸循環(huán)或合成酮體釋放入血液。酮體是脂肪酸在肝內(nèi)正常分解代謝的中間產(chǎn)物，包括β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮，其中含量最多的是β-羥丁酸[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，有86.48%的FHL患貓血液中β-羥丁酸水平高于生理閾值，且脂肪肝組β-羥丁酸水平高于其他肝病患貓和健康貓，這與相關(guān)報(bào)道在患有FHL的貓中，酮體形成增加的結(jié)論相一致[16]。

ROC曲線是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，是用構(gòu)圖法揭示敏感性和特異性的相互關(guān)系，以敏感性為縱坐標(biāo)、(1-特異性)為橫坐標(biāo)繪制成曲線，曲線下面積越大，診斷準(zhǔn)確性越高，因此ROC曲線成為多種疾病診斷性試驗(yàn)的主要分析方法[17-18]。本研究結(jié)果表明，β-羥丁酸對(duì)FHL的診斷具有較高的效能(AUC=0.923)，具有良好的敏感性和特異性，說明β-羥丁酸在FHL診斷中具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

在本研究中，相對(duì)于血β-羥丁酸≥0.828 mmol/L的患貓，血β-羥丁酸<0.828 mmol/L患貓的治愈率明顯提高，療程顯著縮短。因此，血β-羥丁酸水平可指導(dǎo)FHL的臨床治療，對(duì)于β-羥丁酸≥0.828 mmol/L的患貓應(yīng)高度關(guān)注，探討能否通過改變治療方案來提高治療效果。

綜上所述，血清β-羥丁酸水平對(duì)貓脂肪肝診斷具有一定意義，其水平變化與脂肪肝關(guān)系密切。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清β-羥丁酸水平可作為貓脂肪肝診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。