申美倫，張 宇，馬相影，張志恒，李柔茜，金簫迪，高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院/黑龍江實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種信號分子，能夠在細胞內(nèi)起到重要作用而被廣泛應(yīng)用。而一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化后可產(chǎn)生NO。NO可激活環(huán)磷酸鳥苷(guanosine 3′,5′-cyclic phosphate，cGMP)，能夠傳遞細胞間信號[1]。靜松靈作為二甲苯胺噻嗪類似物，是一種α2腎上腺受體激動劑，該藥物的麻醉作用對信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)有顯著的影響[2]。靜松靈在很多種類動物上都能產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和麻醉作用。NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)可使麻醉藥對神經(jīng)產(chǎn)生突觸作用，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛和麻醉效果[3-5]。因此，通過研究了解靜松靈發(fā)揮作用與NO-cGMP信號系統(tǒng)等中樞信號系統(tǒng)之間關(guān)系有重要意義。試驗設(shè)計研究靜松靈對小型豬麻醉的主要作用腦區(qū)中NO、NOS和cGMP變化，擬從小型豬中樞神經(jīng)細胞信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的變化探討靜松靈麻醉作用的分子機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 巴馬小型豬20頭，8月齡～9月齡，雌雄兼用，體重30 kg±5 kg，健康狀態(tài)良好。

1.1.2 試驗藥品與試劑 靜松靈原粉(純度大于99.5%)，東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院外科實驗室提供；NOS、NO、考馬斯亮藍蛋白質(zhì)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；豬cGMP測定試劑盒，中國卡爾文生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Datex-OhmedaS/5TM型重癥監(jiān)護儀，芬蘭Datex-Ohmeda公司產(chǎn)品；IntelliVue MP20監(jiān)護儀，荷蘭Philips公司產(chǎn)品；Sigma 3-30K型高速低溫離心機，德國Sartorius公司產(chǎn)品；普通離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋，河南星宇航天航空儀器廠產(chǎn)品；微量移液器，芬蘭勃雷公司產(chǎn)品；XW-80A型漩渦振蕩器，上海醫(yī)科大學儀器廠產(chǎn)品；BSA224S型電子天平，Sartorius科學儀器北京有限公司產(chǎn)品；U570-86型超低溫冰箱，英格蘭New Brunswick Scientific公司產(chǎn)品；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏試驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；BioTek EpochTM超微量微孔板分光光度計，美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；BioTek ELx50型洗板機，美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；T6新世紀紫外-可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；手動玻璃勻漿器、電動石膏鋸、手術(shù)器械等常規(guī)儀器。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組 從20頭巴馬小型豬中隨機選取5頭注射生理鹽水作為對照組(C組)，其他為靜松靈組。靜松靈組T1、T2、T3時期各5頭。肌內(nèi)注射等量的生理鹽水(10 mL)和靜松靈(0.25 mL/kg)。

1.2.2 樣品的采集與處理 計時并當小型豬注射靜松靈后在平穩(wěn)、深麻醉以及恢復的3種麻醉狀態(tài)選取合適的時間點處死。本試驗選擇3個時間點，分別為T1時期的15 min、T2時期的45 min和T3時期的75 min。達到預定時間點后，麻醉后處死小型豬，取腦并用4 ℃生理鹽水把腦組織上的血沖洗凈，在冰面上立即將大腦皮質(zhì)、小腦、丘腦、海馬和腦干分離后稱重記錄，置于凍存管后放入液氮中等待測定。

1.2.3 腦組織中指標的測定 按照試劑盒說明測定靜松靈對不同腦組織NO含量與NOS活性的影響。cGMP含量也按照ELISA試劑盒說明操作測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法 SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果用平均值±標準差表示；P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 靜松靈對小型豬不同腦區(qū)NOS活性的影響

如圖1所示，相比對照組，其他時期小型豬注射靜松靈后各腦區(qū)NOS活性大體均呈現(xiàn)下降趨勢。在T1平穩(wěn)時期，小型豬海馬中NOS活性受到抑制，差異顯著(P<0.05)。相比之下，大腦皮質(zhì)和腦干中NOS活性受到抑制更明顯；在T2深麻醉時期，大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦和腦干中NOS活性相比T1時期下降更明顯，差異極顯著(P<0.01)；而在T3時期，大腦皮質(zhì)、海馬和腦干中NOS活性持續(xù)明顯下降。僅在丘腦中NOS活性呈現(xiàn)恢復趨勢，差異極顯著(P<0.01)。在各個時期中，小腦中NOS活性無明顯變化。

圖1 靜松靈對小型豬不同腦區(qū)NOS活性影響變化

2.2 靜松靈對小型豬不同腦區(qū)NO含量的影響

如圖2所示，在T1平穩(wěn)時期，小型豬注射靜松靈后大腦皮質(zhì)NO含量下降極顯著(P<0.01)，在海馬和丘腦中NO含量也受到明顯抑制(P>0.05)；在T2深麻醉時期，大腦皮質(zhì)中NO呈上升趨勢，而與T1時期相比，海馬中NO持續(xù)下降，差異顯著(P<0.05)，丘腦明顯持續(xù)下降，差異極顯著(P<0.01)；在T3恢復時期，大腦皮質(zhì)、海馬和丘腦中NO含量均呈現(xiàn)回升趨勢(P>0.05)。在各個時期中，小腦和腦干中NO含量無明顯變化。

圖2 靜松靈對小型豬不同腦區(qū)NO含量影響變化

2.3 靜松靈對小型豬不同腦區(qū)cGMP含量的影響

如圖3所示，在T1平穩(wěn)時期，小型豬注射靜松靈后，各腦區(qū)中cGMP均呈現(xiàn)出下降趨勢，但相比對照組，腦干與海馬中的cGMP下降更明顯，差異顯著(P<0.05)，而與T2時期相比，海馬中cGMP明顯降低，差異顯著(P<0.05)；在T2深麻醉時期，腦干和大腦皮質(zhì)中cGMP持續(xù)保持下降，與對照組相比差異顯著(P<0.05)；在T3恢復時期，所有腦區(qū)中cGMP均回歸初始水平(P>0.05)。在各個時期中，丘腦和小腦中cGMP含量無明顯變化。

圖3 靜松靈對小型豬不同腦區(qū)cGMP含量性影響變化

3 討論

NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)能夠參與多種機體系統(tǒng)功能狀態(tài)的變化[6]。近些年的一些相關(guān)研究表明該系統(tǒng)對突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和攝取、神經(jīng)元的分化和生長、神經(jīng)傳遞、神經(jīng)炎性反應(yīng)及部分基因表達等都具有調(diào)控作用[7-9]。一氧化氮作為一種細胞內(nèi)和細胞間遞質(zhì)物質(zhì)，其在神經(jīng)元組織在內(nèi)的多種組織中都能由一氧化氮合酶催化合成。在細胞內(nèi)，一氧化氮與鳥苷酸環(huán)化酶的部分結(jié)合，從而增加cGMP的含量。據(jù)研究表明，α2腎上腺素受體激活后，全麻藥可以通過興奮受體改變NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，從而增加或減少細胞內(nèi)的cGMP含量[10]。靜松靈作為一種α2腎上腺素能受體激動劑，其麻醉作用可能與NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)有關(guān)[11]。麻醉藥與NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的作用機理有受體水平、NOS或sGC 3種。3種作用機理都能夠調(diào)控cGMP。cGMP又作為第二信使可使蛋白激酶、磷酸二酯酶和離子通道等結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)活性。這些結(jié)構(gòu)也可能與靜松靈的麻醉作用相關(guān)。

在劉煥奇[12]對噻拉唑?qū)Υ笫蟛煌X區(qū)cGMP含量的影響研究中，結(jié)果表明噻拉唑能明顯抑制大鼠大腦皮質(zhì)、海馬和腦干cGMP含量，也說明了麻醉藥與cGMP的關(guān)系，這與我們的結(jié)果基本一致。在文獻[13-14]中與本試驗比較中發(fā)現(xiàn)不同時間段呈現(xiàn)的趨勢相似。當小型豬注射靜松靈后，在T1平穩(wěn)期，各腦區(qū)的不同組織的活性或含量大體出現(xiàn)了下降趨勢。而在T2深麻醉期，隨著麻醉時間的增加，除了大腦皮質(zhì)中NO呈上升趨勢外，各腦區(qū)的不同組織的活性或含量大體下降更顯著。在T3恢復期，除大腦皮質(zhì)、海馬和腦干中NOS活性持續(xù)明顯下降外，各腦區(qū)的不同組織的活性或含量整體恢復到初始水平。這也與巴馬小型豬的行為學變化相一致。本試驗結(jié)果證明，小型豬注射靜松靈后，各腦區(qū)中不同組織的含量及活性均出現(xiàn)了不同程度的下降趨勢。除小腦外，其他腦區(qū)NOS明顯受到抑制。同時，小型豬中大腦皮質(zhì)、海馬和丘腦3個腦區(qū)內(nèi)NO也發(fā)現(xiàn)顯著降低，而且大腦皮質(zhì)、丘腦和腦干3個腦區(qū)內(nèi)的cGMP也明顯減少。師銘咸等[15]研究表明咪達唑侖對山羊大腦、海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)NOS活性、NO含量、cGMP濃度有明顯抑制作用，由此對于靜松靈麻醉機制的作用其可能是抑制NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的結(jié)果。影響靜松靈麻醉效果有很多種，本文只是針對靜松靈和NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)之間進行研究。單一的全麻藥對于小型豬的研究可能還不夠，NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)對于小型豬的麻醉也只是重要的靶點之一。NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在小型豬麻醉過程中的作用，對于闡明靜松靈的麻醉機制具有重要意義。

本研究證明，小型豬注射靜松靈后，主要在大腦皮質(zhì)、海馬、丘腦和腦干中的NOS、NO和cGMP參與了靜松靈的麻醉過程，與其麻醉作用能夠抑制NO-cGMP信號系統(tǒng)密切相關(guān)。