伊立超，李樂天，郝嘉翼，時(shí)小雙，張 爽，徐 鵬，任世斌，高 旭*，李 昌*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院人獸共患病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新單元，吉林長春 130122)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是豬的一種高度接觸性腸道傳染病，1946年在美國第一次報(bào)道發(fā)生該病，1960年以來，中國開始報(bào)道豬傳染性胃腸炎，該病是目前導(dǎo)致仔豬發(fā)病甚至死亡的重要原因，嚴(yán)重影響中國豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]。多數(shù)病死豬表現(xiàn)嚴(yán)重的脫水和體重下降情況，同時(shí)發(fā)現(xiàn)小腸和胃部有卡他性炎癥[3]。豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastro enteritis virus，TGEV)是TGE的病原，為冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，屬于Ⅰ型冠狀病毒。病毒粒子多為球狀或橢球形，直徑為80 nm～200 nm[4-5]。研究表明，豬傳染性胃腸炎病毒基因組重組率非常高，類似于分節(jié)段的RNA病毒[6-7]，病毒表面的纖突蛋白(Spike,S)介導(dǎo)細(xì)胞附著和膜融合[8]。TGEV的結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體并對機(jī)體能提供免疫保護(hù)作用，而且有宿主細(xì)胞受體的識別位點(diǎn)，決定了對宿主細(xì)胞的感染性和血凝性等作用，是當(dāng)前豬傳染性胃腸炎病毒基因工程疫苗的重要研究方向，有很大的研究潛力[9]。而豬傳染性胃腸炎病毒S1蛋白中有一個(gè)重要片段，氨基酸殘基位置在523-666位，該片段為受體結(jié)合域(receptor-binding domain，RBD)[10-11]，是決定病毒和受體相作用的關(guān)鍵因素，因此也決定著病毒的宿主來源和親嗜性[12]。

國內(nèi)目前用來預(yù)防豬傳染性胃腸炎(TGE)的疫苗有滅活疫苗和弱毒活疫苗，但免疫效果較差。而且近年來豬傳染性胃腸炎病毒突變株的流行，使得原來的疫苗效果甚微。為此，本試驗(yàn)針對豬傳染性胃腸炎病毒的纖突蛋白(Spike,S)中的受體結(jié)合域(RBD)，應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行TGEV-RBD基因表達(dá)，為豬傳染性胃腸炎診斷和亞單位疫苗研制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 標(biāo)準(zhǔn) Marker、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；FastBacTM雙載體、EcoRⅠ、XbaⅠ、DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Anti-strep tag抗體，Abcam公司產(chǎn)品；抗TGEV多克隆抗體，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院人獸共患病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新單元實(shí)驗(yàn)室制備；小鼠抗β-actin抗體，中杉金橋公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記Goat Anti-Mouse IgG、FITC標(biāo)記Goat Anti-Mouse IgG，碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z)，上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；超級潔凈工作臺(DL-CJ-2N)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；智城恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-2102C)，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank登錄的豬傳染性胃腸炎病毒全基因組序列(ID:ABC72414.1)，選取其受體結(jié)合域(Receptor binding domain,RBD)基因序列，上、下游分別添加EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)完成后，根據(jù)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后由南京金斯瑞公司合成。

1.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 將合成的TGEV-RBD亞克隆至桿狀病毒雙表達(dá)載體的PH啟動子下游，命名為pFBD-TGR，用EcoRⅠ、XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.3 重組桿粒的制備 將鑒定正確的質(zhì)粒pFBD-TGR轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于三抗瓊脂平板(含有四環(huán)素、卡鈉霉素、慶大霉素、IPTG/X-Gal)上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h。挑取較大的中央無灰色的白色菌落到三抗(成分同上)培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，進(jìn)行菌液PCR鑒定，上游引物為PHF：5′-TTCATACCGTCCCACCAT-3′，下游引物為M13通用引物反向引物，鑒定正確后，堿裂解法提取桿粒，命名為Bacmid-TGR。

1.2.4 重組桿狀病毒的拯救 在培養(yǎng)皿中接種sf9細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)8 h～12 h，更換2 mL完全培養(yǎng)基(含15 mL/L胎牛血清Grace's培養(yǎng)基)，使用無抗無血清Grace's培養(yǎng)基分別與重組桿粒Bacmid-TGR(4 μg)與CellfectinTMⅡ Reagent(4 μL)混勻，靜置20 min均勻加入培養(yǎng)皿中，置于27 ℃培養(yǎng)箱，4 h～5 h后更換完全培養(yǎng)基，27 ℃培養(yǎng)6 d～7 d，離心收取上清即為第1代重組桿狀病毒rBV-TGR，繼續(xù)傳3代。

1.2.5 間接免疫熒光鑒定TGEV-RBD蛋白的表達(dá) 在6孔板中接種sf9細(xì)胞，待細(xì)胞長滿70%左右，每孔接種20 μL第3代重組桿狀病毒rBV-TGR。27 ℃靜置培養(yǎng)2 d后，培養(yǎng)基吸出備用。用細(xì)胞固定液固定0.5 h，2 mL/L Trion X-100室溫反應(yīng)10 min，PBS清洗3次。50 g/L脫脂乳封閉1 h，1 000倍稀釋的Anti-strep tag室溫孵育2 h，PBS清洗3次。2 000倍稀釋FITC-標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG，室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次。用熒光顯微鏡觀察。

1.2.6 Western blot檢測TGEV-RBD蛋白的表達(dá) 取1.2.4中吸出的培養(yǎng)基，3 000 r/min離心5 min，制成蛋白樣品。凝膠電泳后，用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)印蛋白至NC膜上，分別用1∶1 000稀釋Anti-strep tag和1∶100稀釋的抗豬傳染性胃腸炎病毒多克隆抗體為一抗，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記Goat Anti-Mouse IgG為二抗，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.7 TGEV-RBD蛋白的表達(dá)優(yōu)化 確定蛋白為可溶性表達(dá)之后，按照接毒量1 MOI、5 MOI、8 MOI、10 MOI和表達(dá)時(shí)間72 h、96 h進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化，提高TGR蛋白的表達(dá)效率。接毒后按照以上時(shí)間每次收集1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，然后將細(xì)胞培養(yǎng)液1 000 r/min離心5min后收集上清液，進(jìn)行Western blot鑒定，然后將Western blot條帶經(jīng)內(nèi)參修正后進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 TGEV-RBD基因測序結(jié)果分析

本研究所選取的目的基因序列來自于中國流行株(NCBI ID：ABC72414.1)，將其與幾種比較典型毒株的TGEV-RBD序列進(jìn)行基因進(jìn)化分析(圖1)，同源性分析顯示，該氨基酸序列與其他分離株的同源性介于96.5%～100%，表明受體結(jié)合域(RBD)基因氨基酸序列具有較高的保守性。

圖1 TGEV-RBD基因分析

2.2 目的基因設(shè)計(jì)與合成

以TGEV流行株(NCBI ID：ABC72414.1)S蛋白為基礎(chǔ)，利用信號肽預(yù)測工具，保留氨基酸殘基1-16位置作為信號肽，523-666位置為受體結(jié)合域(RBD)(圖2A)，同時(shí)，N端添加kozak起始序列、Twin-Strep標(biāo)簽，兩端分別添加酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XbaⅠ(圖2B)。

圖2 TGEV-RBD基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 重組質(zhì)粒鑒定

用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pFBD-TGR，結(jié)果顯示，可得到1條700 bp左右的目的基因條帶，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3)，DNA測序鑒定結(jié)果同時(shí)表明，目的序列與原序列完全一致。

2.4 重組桿粒的鑒定

利用上述引物對菌液直接進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，應(yīng)用引物PHF和M13通用引物擴(kuò)增可見大小約為1 000 bp的單一條帶(圖4)，表明重組Bacmid-TGR構(gòu)建成功。

2.5 重組桿狀病毒的獲得

用重組Bacmid-TGR轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞6 d～7 d產(chǎn)生第1代重組桿狀病毒，此時(shí)細(xì)胞均有細(xì)胞變圓、變大、漂浮，貼壁細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核明顯增大(圖5B)，出現(xiàn)典型CPE(圖5C)，而正常細(xì)胞無變化(圖5A)，表明獲得了重組桿狀病毒。

2.6 間接免疫熒光鑒定TGEV-RBD蛋白的表達(dá)

利用Anti-strep tag抗體對重組桿狀病毒感染的sf9細(xì)胞進(jìn)行IFA鑒定，結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)染的sf9細(xì)胞未出現(xiàn)熒光(圖6A)，而轉(zhuǎn)染rBV-TGR的sf9細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光(圖6B)，表明TGEV-RBD基因在桿狀病毒中成功表達(dá)。

2.7 重組蛋白TGEV-RBD的蛋白印跡檢測

將重組Bacmid-TGR轉(zhuǎn)染至sf9細(xì)胞，置27 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 d～7 d后，大量細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收取上清，并將20 μL上清接種至將近鋪滿sf9細(xì)胞的6孔板內(nèi)，重復(fù)傳至第3代，待細(xì)胞出現(xiàn)大量病變且有漂浮時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)液離心取上清，凝膠電泳后，用Anti-strep tag和抗TGEV多克隆抗體分別作為一抗進(jìn)行蛋白印跡檢測，有大小為28 ku目的蛋白條帶產(chǎn)生，表明TGEV-RBD蛋白成功表達(dá)(圖7)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.重組質(zhì)粒; 2.重組質(zhì)粒雙酶切

2.8 TGEV-RBD蛋白表達(dá)的條件優(yōu)化

將72 h、96 h按照接毒量1 MOI、5 MOI、8MOI、10 MOI收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液3 000 r/min離心5 min后收集上清液，進(jìn)行Western blot鑒定(圖8)，將96 h的條帶用Image J進(jìn)行灰度分析，用內(nèi)參進(jìn)行修正后，用GraphPad Prism 6.02作圖分析，T檢驗(yàn)顯示除1、2組外，其他均滿足P<0.01，表明10 MOI、96 h的表達(dá)量為最高(圖9)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.Strep tag抗體鑒定重組蛋白pFBD-TGR; 2.空白對照; 3.抗TGEV多克隆抗體鑒定重組蛋白pFBD-TGR

1～4.接毒量1 MOI、5 MOI、8 MOI、10 MOI

1～4.接毒量1 MOI、5 MOI、8 MOI、10 MOI

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.菌液PCR; 2.空白對照

A.正常的sf9細(xì)胞; B.重組桿粒Bacmid-TGR轉(zhuǎn)染120 h的sf9細(xì)胞病變;C.P3代重組桿狀病毒感染48h的sf9細(xì)胞病變

A.正常sf9細(xì)胞; B.重組桿粒Bacmid-TGR轉(zhuǎn)染120 h的sf9細(xì)胞

3 討論

纖突蛋白(Spike,S)能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體并能對機(jī)體提供免疫保護(hù)作用,而且有宿主細(xì)胞受體的識別位點(diǎn),決定了對宿主細(xì)胞的感染性和血凝性等作用[9]。

王艷春[13]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)TGEV S基因的抗原A蛋白，并成功制備出單克隆抗體。杜穎卉等[14]構(gòu)建了TGEV S基因的重組乳酸菌，小鼠口服后，血清IgG與糞便sIgA均有顯著性提高。宋林林[15]構(gòu)建了TGEV S基因真核表達(dá)載體并成功表達(dá)。受體結(jié)合域(RBD)蛋白是TGEV S蛋白的截短表達(dá)，能夠阻斷病毒感染細(xì)胞，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，是刺激宿主免疫反應(yīng)、中和抗體產(chǎn)生的主要抗原成分。宿主細(xì)胞和病毒的結(jié)合與TGEV-RBD蛋白密切相關(guān)[12]，受體結(jié)合域(RBD)的受體結(jié)合基序與細(xì)胞受體相互作用，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的黏附。針對S蛋白受體結(jié)合域(RBD)的特異性中和單克隆抗體可以有效地阻斷病毒入侵，它被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)[16]。查閱資料，暫未發(fā)現(xiàn)表達(dá)TGEV受體結(jié)合區(qū)(TGEV-RBD)的表達(dá)研究。

真核表達(dá)系統(tǒng)相比于原核表達(dá)系統(tǒng)，對翻譯后的蛋白的加工修飾作用，使其更接近天然蛋白質(zhì)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是成熟且高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)外源蛋白的生物學(xué)活性、免疫原性、功能特性等均與天然蛋白幾乎相同[17]，而且桿狀病毒不感染脊椎動物，表達(dá)的產(chǎn)物具有高度的生物安全性[18]。

本試驗(yàn)將TGEV-RBD基因成功克隆至桿狀病毒表達(dá)載體，構(gòu)建了pFBD-TGR質(zhì)粒，并獲得穿梭質(zhì)粒Bacmid-TGR，將穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBV-TGR，并表達(dá)了TGEV-RBD蛋白，所表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量約28 ku；間接免疫熒光和Western blot均表明，TGEV-RBD蛋白具有良好的抗原性，為進(jìn)一步研究TGEV-RBD蛋白的生物學(xué)功能、研發(fā)診斷試劑、制備亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)，也為利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行其他冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)提供了借鑒和參考。