萬仕成，趙建帥，肖 妍，王 瑩，劉晨熙，崔伊檬，張 金，惠喬岳，楊松樺，張瑩利，武永杰，徐永平

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

大黃素(emodin)是大黃、虎杖、何首烏等常見中草藥的一種重要的藥用活性成分，屬于天然蒽醌類衍生物[1]，廣泛用于醫(yī)療、保健和日用化工品以及飼料(魚、蝦)[2]中。大黃素具有抗腫瘤[3-5]、抑菌[6-7]、免疫抑制[8]、解痙、止咳、利尿、瀉下等諸多生物學(xué)作用[9-10]。蔣軍等[11]分析研究文獻總結(jié)大黃素對胃腸動力促進作用的可能機制包括調(diào)控信號通道(Na+、Ca2+、Cl-通路)、調(diào)節(jié)卡哈爾氏間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、調(diào)節(jié)胃腸道激素等。黃偉鋒等[12]觀察到經(jīng)家兔經(jīng)耳緣靜脈注射大黃素后，胃肌電活動受到抑制；經(jīng)中縫大核注射大黃素可抑制胃肌電活動，經(jīng)蒼白核注射大黃素可使胃電頻率增強。近年來數(shù)學(xué)建模在構(gòu)建DNA雙分子模型、傳染病模型、療效評定模型等生物學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[13]，有助于進一步揭示相關(guān)生物學(xué)現(xiàn)象的宏觀調(diào)控機制[14]。大黃素對胃腸道運動的影響，是否可以通過數(shù)學(xué)建模揭示其內(nèi)在規(guī)律？因此，本試驗采用生物信號監(jiān)測系統(tǒng)采集經(jīng)耳緣靜脈注射不同劑量大黃素對家兔十二指腸肌電活動作用的數(shù)據(jù)，并構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，旨在闡明大黃素對家兔十二指腸作用的量效關(guān)系，為揭示大黃素對十二指腸作用的內(nèi)在機制以及大黃素類藥物的研發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4月齡健康家兔，平均體重2.0 kg±0.3 kg，購自陜西省咸陽市武功縣玉兔養(yǎng)殖場，保障動物福利的條件下，于干凈、衛(wèi)生的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于試驗。

1.1.2 藥物與試劑 大黃素粉劑，潤友化學(xué)(深圳)有限公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMSO)，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。參照黃偉鋒等[12]的方法，使用二甲基亞砜助溶大黃素粉劑，配置成3 mg/mL的大黃素-5 mL/L二甲基亞砜生理鹽水注射液。

1.1.3 主要儀器 BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)，成都泰盟軟件有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 不同劑量大黃素對家兔十二指腸肌電活動的影響 參照杜宜楠等[15]的方法，受試家兔均手術(shù)埋置電極建立十二指腸肌電活動監(jiān)測動物模型。33只家兔按照大黃素劑量隨機分為對照組、1、2、3、4、5、6、8、10、12、15 mg/kg等10個給藥劑量組。對照組使用等量的5 mL/L二甲基亞砜生理鹽水溶液替代注射。監(jiān)測前，待測家兔禁食禁水12 h后，通過家兔置于保定盒內(nèi)，將留置的兩根BV純銅導(dǎo)線分別連入BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，設(shè)置參數(shù)為：增益：1 mV，時間常數(shù)：1 s，濾波：10 Hz，掃描速度：2.5 s/div。觀察記錄波形圖，待其穩(wěn)定后持續(xù)監(jiān)測記錄肌電活動10 min，作為自身對照。經(jīng)耳緣靜脈注射相應(yīng)劑量的3 mg/mL大黃素注射液，持續(xù)觀察待波形圖穩(wěn)定后，記錄60 min。監(jiān)測過程中觀察并記錄家兔對藥物反應(yīng)的體征變化。試驗完畢后拆除導(dǎo)線，動物置于安靜清潔舒適的環(huán)境中進行飼喂，經(jīng)過大黃素休藥期后，保障動物福利對家兔進行處置。將所得肌電波形按照6 min記錄的波形圖作為一個數(shù)據(jù)樣本，將所得的每個記錄結(jié)果(波形圖)隨機采集3個數(shù)據(jù)樣本，每個數(shù)據(jù)樣本提取振幅(單位：mV)和頻率(單位：min-1)，按照振幅乘以頻率的方式，換算為肌電活動指數(shù)(單位：mV/min)。采用SPSS 20.0 軟件分別對試驗采集的振幅、頻率以及肌電活動指數(shù)按照單因素方差分析(單因素ANOVA,Duncan)進行組間差異顯著性分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”的形式表示。

1.2.2 大黃素對十二指腸肌電活動影響的數(shù)模構(gòu)建與分析 基于“1.2.1”采用SPSS 20.0 軟件進行的生物學(xué)統(tǒng)計分析的結(jié)果，利用Origin 2017軟件繪制大黃素的劑量變化與肌電活動指數(shù)二者關(guān)系的散點圖，分析兩者可能符合的函數(shù)類型，并以其為模板，擬合出表示大黃素劑量與肌電活動指數(shù)關(guān)系最優(yōu)的函數(shù)參數(shù)，進而獲得函數(shù)表達式。對獲得的函數(shù)表達式進行擬合精度分析，選擇同樣條件下函數(shù)表達式的決定系數(shù)(R2)最大且大于0.95的同時P值最小且小于0.05的最優(yōu)函數(shù)表達式。根據(jù)所得函數(shù)表達式各參數(shù)的特點，分析大黃素對十二指腸肌電活動影響的作用機制。

1.2.3 大黃素對十二指腸肌電活動影響的阿托品阻斷試驗 基于“1.2.1”采用SPSS 20.0軟件進行的生物學(xué)統(tǒng)計分析的結(jié)果，使用0.02 mg/kg的硫酸阿托品分別與對照組、促進或抑制作用最明顯的大黃素劑量組聯(lián)合作用。每個劑量組3只。采用“1.2.1”的方法建立動物模型，在測量前5 min對動物模型經(jīng)肌肉注射0.02 mg/kg的硫酸阿托品，后續(xù)按照上述方法進行肌電活動監(jiān)測，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 耳緣靜脈注射大黃素后家兔體征的變化

給藥前各試驗家兔體征均正常，耳緣靜脈注射大黃素注射液后，8 mg/kg及以下劑量組家兔未見明顯異常。而10 mg/kg劑量組給藥后，家兔開始出現(xiàn)焦躁不安等癥狀，隨著劑量增加部分家兔偶爾出現(xiàn)四肢抽搐、角弓反張等神經(jīng)癥狀，給藥后24 h內(nèi)部分家兔甚至出現(xiàn)血便的消化道病理癥狀。表明大黃素給藥劑量低于8 mg/kg時無明顯毒副作用，而高劑量大黃素則可以誘發(fā)明顯的神經(jīng)癥狀，甚至造成下消化道出血的嚴重病理癥狀。

2.2 不同劑量大黃素對十二指腸肌電活動的影響

對比不同劑量大黃素對十二指腸肌電活動影響的波形示意圖(圖1)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大黃素給藥劑量小于5 mg/kg，肌電活動強于對照組，且波形圖呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；當(dāng)大黃素給藥劑量大于6 mg/kg，肌電活動弱于對照組，給藥劑量在8 mg/kg時，肌電活動最弱。

各試驗組和對照組的肌電活動指數(shù)分析結(jié)果見表1。

表1 不同劑量大黃素對家兔十二指腸肌電活動影響的統(tǒng)計結(jié)果

與對照組相比，5、12、15 mg/kg劑量組的十二指腸肌電活動指數(shù)差異不顯著(P>0.05)；1、2、3、4 mg/kg劑量組的肌電活動表現(xiàn)為促進作用，肌電活動指數(shù)差異為顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)； 6、7、8、9、10 mg/kg劑量組的肌電活動表現(xiàn)為抑制作用，肌電活動指數(shù)差異為顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。

各相鄰試驗組組間差異分析表明，具有促進作用的相鄰劑量組，1 mg/kg和2 mg/kg、2 mg/kg和3 mg/kg之間差異極顯著(P<0.01)，4 mg/kg和5 mg/kg之間差異顯著(P<0.05)，3 mg/kg和4 mg/kg組間差異不顯著(P>0.05)；具有抑制作用的相鄰劑量組， 6 mg/kg和8 mg/kg、8 mg/kg和10 mg/kg之間差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg和12 mg/kg、12 mg/kg和15 mg/kg組間差異不顯著(P>0.05)。

1.對照組；A.1 mg/kg;B.2 mg/kg;C.3 mg/kg;D.4 mg/kg;E.5 mg/kg;F.6 mg/kg;G.8 mg/kg;H.10 mg/kg;I.12 mg/kg;J.15 mg/kg

統(tǒng)計分析結(jié)果表明，大黃素對十二指腸肌電活動的作用有明顯的濃度依賴性。在1 mg/kg～2 mg/kg時，肌電活動指數(shù)增高；在2 mg/kg～8 mg/kg時，肌電活動活動指數(shù)持續(xù)下降，并且在6 mg/kg時大黃素的作用效果由促進變?yōu)橐种?；? mg/kg～15 mg/kg時肌電活動有所升高但并未回到正常肌電活動(對照組)。以對照組為參照，表現(xiàn)為一正一反雙峰型變化趨勢。

2.3 大黃素對十二指腸肌電活動影響的數(shù)學(xué)模型構(gòu)建與分析

根據(jù)“2.2”統(tǒng)計分析結(jié)果，以大黃素劑量為橫坐標(x)，肌電活動指數(shù)為縱坐標(y)繪制散點圖(圖2)，肌電活動指數(shù)的分布趨勢以對照組為基準，隨大黃素劑量的增加，呈現(xiàn)出一正一反雙峰型不對稱曲線；因此選擇extreme極值函數(shù)作為模板，即y=y0+A×exp{-exp[-(x-xc)/ω+1]}，采用Origin 2017軟件進行雙峰型函數(shù)擬合，擬合曲線圖見圖3。得到峰擬合1，其函數(shù)y1表達式為：y1=3.693+4.608×exp{-exp[-(x-1.821)/1.023]-(x-1.821)/1.023+1}；峰擬合2，其函數(shù)y2表達式為：y2=3.693-2.386×exp{-exp[-(x-7.832)/1.945]-(x-7.832)/1.945+1}。

圖2 不同劑量大黃素與十二指腸肌電活動指數(shù)關(guān)系的散點圖

圖3 大黃素劑量與十二指腸肌電活動指數(shù)的雙峰擬合示意圖

累積峰值擬合曲線F(x)。由于大黃素0、5、15 mg/kg在峰擬合1和峰擬合2中沒有數(shù)學(xué)意義，但其有實際的生物學(xué)意義。因此累積峰值擬合曲線F(x)更好反映了大黃素劑量與十二指腸肌電活動指數(shù)實際關(guān)系。因此引入階躍函數(shù)建立累積峰值擬合曲線F(x)表達式，即F(x)=a(x)×y1+b(x)×y2。

分析函數(shù)F(x)：獨立隨機變量y0為3.693，參考趙建帥等[16]對y0的分析，本試驗y0與自變量x(大黃素劑量)無關(guān)，表明大黃素對十二指腸肌電活動的作用是在十二指腸肌電活動內(nèi)在的調(diào)控機制的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。

當(dāng)大黃素劑量小于等于5.189 mg/kg時，則F(x)=y1，大黃素對十二指腸肌電活動表現(xiàn)促進作用。當(dāng)大黃素劑量為xτ1即1.821 mg/kg時，肌電活動指數(shù)達到最大值為8.301 mV/min；此時，大黃素劑量(x)對肌電活動指數(shù)(y)的促進作用達到最大，為參A1，即4.608 mV/min；函數(shù)的標準差ω1為1.023，說明大黃素劑量在0.798(xτ1-ω1)mg/kg～2.844(xτ1+ω1)mg/kg-1區(qū)間內(nèi)，對十二指腸肌電活動有顯著的促進作用。

當(dāng)大黃素劑量在5.189 mg/kg～15 mg/kg時，則F(x)=y2，大黃素對十二指腸肌電活動表現(xiàn)抑制作用。當(dāng)大黃素劑量為xτ2即7.832 mg/kg時，肌電活動指數(shù)達到最小值為1.307 mV/min；此時，大黃素劑量(x)對肌電活動指數(shù)(y)的抑制作用達到最大，為參數(shù)A2，即2.386 mV/min；函數(shù)的標準差ω2為1.945，說明大黃素劑量在5.887(xτ2-ω2)mg/kg～9.777(xτ2+ω2)mg/kg區(qū)間內(nèi)，對十二指腸肌電活動有顯著的抑制作用。

以上結(jié)果表明，大黃素劑量在0.798 mg/kg～2.844 mg/kg區(qū)間內(nèi)，為有效促進濃度，在5.887 mg/kg～9.777 mg/kg區(qū)間內(nèi)為有效抑制濃度。

2.4 大黃素對十二指腸肌電活動影響的阿托品阻斷試驗結(jié)果

根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果，以未阻斷的二甲基亞砜生理鹽水替代組為參照，選取二甲基亞砜生理鹽水替代組與2 mg/kg、8 mg/kg大黃素劑量組進行阿托品阻斷試驗，十二指腸肌電活動波形如圖4，統(tǒng)計學(xué)分析見表2。與對照組相比，阻斷對照組、2 mg/kg、8 mg/kg大黃素劑量組的肌電活動指數(shù)均大幅下降，差異極顯著(P<0.01)；3個阻斷組之間的肌電活動指數(shù)極為接近，差異不顯著(P>0.05)，表明阿托品阻斷了大黃素對十二指腸肌電活動的作用。

表2 阿托品聯(lián)合大黃素對家兔十二指腸肌電活動的影響

1.對照組;K.阻斷對照組,L.2 mg/kg;M.8 mg/kg

3 討論

3.1 大黃素對十二指腸肌電活動作用的特點及臨床意義

近年來中西醫(yī)結(jié)合逐漸成為研究的重要趨向，有關(guān)大黃素對消化道的作用也有了更多的關(guān)注。郝宗艷等[17]使用大黃素(40 mg/kg)灌服消化不良小鼠7 d，發(fā)現(xiàn)其對胃腸運動有一定的促進作用。但高柳等[18]將大黃素作用于離體小鼠十二指腸，發(fā)現(xiàn)大黃素對十二指腸產(chǎn)生抑制作用，且抑制效果隨大黃素劑量的升高而增高。盧春敬等[19]發(fā)現(xiàn)大黃素對豚鼠結(jié)腸產(chǎn)生先促進后抑制的濃度依賴性作用。葉冬梅等[20]發(fā)現(xiàn)大黃素對大鼠游離空腸平滑肌和結(jié)腸平滑肌的收縮有雙向調(diào)節(jié)作用。本試驗通過監(jiān)測大黃素對電極埋置模型家兔的十二指腸肌電指標，結(jié)果表明,大黃素對胃腸道平滑肌運動作用效果具有濃度依賴性，且隨大黃素劑量的增加，肌電活動指數(shù)出現(xiàn)了先增加后減小再增加的一正一反雙峰型變化趨勢。同時本試驗在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，高劑量組部分家兔出現(xiàn)明顯的病理癥狀。并且黃婉奕等[21]發(fā)現(xiàn)高劑量大黃素對小鼠腎臟有一定毒性,Chen Y L等[22]指出長期或大劑量使用大黃素會引起肝臟毒性。提示在臨床使用大黃素類藥物時，須嚴格控制其劑量才有可能達到治療目的，尤其是再利用其抑制作用時需謹慎，并防范可能的副作用風(fēng)險。

3.2 大黃素對家兔十二指腸肌電活動數(shù)學(xué)建模及其作用機制分析

陳鵬[23]發(fā)現(xiàn)大黃素可能通過影響長時程增強、谷氨酸突觸傳遞、鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多條途徑發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。周成華等[24]使用大黃素灌服便秘小鼠，發(fā)現(xiàn)其對小腸有促進作用，且與抑制Na+、K+-ATP酶有關(guān)。黃偉鋒等[12]將大黃素經(jīng)耳緣靜脈注射于家兔，胃電活動被明顯抑制，但在胃的不同部位大黃素的作用效果強度不同。當(dāng)在延髓的內(nèi)側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中縫大核的不同位點微量注射大黃素時，家兔胃四個部位的肌電活動呈現(xiàn)較為復(fù)雜的變化：P7位點注射大黃素可抑制胃的賁門部、胃底部、胃大彎與胃竇之間的肌電活動，興奮胃竇；P8.5位點注射大黃素僅可抑制賁門部；P9.5位點注射大黃素，賁門部、胃大彎與胃竇之間和胃竇受到抑制；P11位點注射胃大彎與胃竇之間表現(xiàn)抑制，而賁門部、胃底部和胃竇的肌電頻率變快。上述研究表明大黃素可以通過神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用，并且在同一器官，不同位置，作用效果不同。

本試驗按照extreme極值函數(shù)為模板構(gòu)建獲得了以大黃素劑量為自變量，十二指腸肌電活動指數(shù)為因變量的高擬合精度的函數(shù)模型。函數(shù)分析表明獨立隨機變量y0為3.693，與自變量x(大黃素劑量)無關(guān)，其生物學(xué)意義是反映十二指腸肌電活動內(nèi)在的調(diào)控機制。而大黃素作為次級因素對十二指腸肌電活動的作用是在十二指腸肌電活動內(nèi)在的調(diào)控機制的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。眾所周知，十二指腸肌電活動的內(nèi)在調(diào)控機制是基于胃腸道的間質(zhì)細胞、腸神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)構(gòu)成的多層級的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)的，神經(jīng)系統(tǒng)占主導(dǎo)地位。因而大黃素對十二指腸肌電活動作用可能是依賴于胃腸道的多層級的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)的。

此外，與統(tǒng)計分析結(jié)果相比較，本試驗通過對函數(shù)模型各參數(shù)的分析，更為精確、細致地描述了大黃素對十二指腸肌電活動的濃度依賴性調(diào)節(jié)作用的特征，即大黃素對十二指腸發(fā)揮明顯作用的劑量范圍確定為0.798 mg/kg～2.844 mg/kg(促進作用)和5.887 mg/kg～9.777 mg/kg(抑制作用)，在該范圍內(nèi)，大黃素劑量以0.798、1.821、2.844、5.887、7.832、9.777 mg/kg為分界點，肌電活動的變化趨勢分別表現(xiàn)為連續(xù)的指數(shù)型增長、對數(shù)型增長、對數(shù)型降低、指數(shù)型降低、對數(shù)型降低、對數(shù)型增長以及指數(shù)型增長。該函數(shù)可作為大黃素類藥物影響十二指腸運動的藥效評估模型，為大黃素類藥物的研發(fā)和臨床上精準用藥提供重要的數(shù)據(jù)依據(jù)和參考。

3.3 阿托品聯(lián)合大黃素對十二指腸肌電活動的影響

阿托品是抗膽堿藥，為M-受體阻斷劑[25]，可與乙酰膽堿競爭副交感神經(jīng)節(jié)后纖維突觸后膜的乙酰膽堿M-受體，從而拮抗過量乙酰膽堿對突觸后膜刺激所引起的毒蕈堿樣癥狀和中樞神經(jīng)癥狀。黃偉鋒等[12]在家兔中縫大核微量注射阿托品可翻轉(zhuǎn)大黃素作用，切斷迷走神經(jīng)再注射大黃素，可使抑制作用減弱或轉(zhuǎn)為興奮，提示大黃素在該位點可能是通過膽堿能途徑發(fā)揮作用。本試驗在硫酸阿托品分別與2 mg/kg、8 mg/kg大黃素聯(lián)合用藥試驗結(jié)果表明，大黃素的對十二指腸的促進或抑制作用均可被阿托品阻斷，提示大黃素對十二指腸的促進或抑制作用依賴于膽堿能神經(jīng)。這一結(jié)果與黃偉鋒等的試驗結(jié)果互為驗證，在不同層次和位點證實了大黃素對通過膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的作用，實現(xiàn)調(diào)節(jié)胃腸肌電活動的作用機制。

綜上所述，大黃素在其作用劑量范圍內(nèi)對十二指腸有低劑量促進、高劑量抑制的調(diào)節(jié)作用，且這種調(diào)節(jié)作用是基于十二指腸有一定的活動基礎(chǔ)實現(xiàn)的，即大黃素只能作為調(diào)控十二指腸活動的次級因素，并且大黃素對十二指腸肌電活動的影響，可能是通過作用于膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)間接支配消化道平滑肌實現(xiàn)的。