段續(xù)接，楊 惠，劉淑英

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院/內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

外源性綿羊肺腺瘤病毒(Exogenous jaagsiekte sheep retrovirus,exJSRV)屬于β逆轉(zhuǎn)錄病毒，結(jié)構(gòu)和基因序列與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相似[1]。病毒的囊膜蛋白Env由env編碼，包含表面蛋白(surface protein unit,SU)和跨膜蛋白(transmembrane protein domain,TM) 2個結(jié)構(gòu)域，其中SU與細胞表面的特異性受體結(jié)合，TM在病毒感染細胞時與細胞膜發(fā)生融合[2]。大量研究表明，JSRV-env為致癌基因，其編碼的囊膜蛋白(Env)主要影響影響細胞的增殖[3]。

JSRV Env可以在多種體外細胞系中誘導細胞轉(zhuǎn)化[4]。作者所在實驗室孫曉林等[5]通過用pcDNA4/myc-his/exJSRV-env重組表達質(zhì)粒誘導小鼠成纖維細胞系NIH3T3轉(zhuǎn)化；Thomas E A利用pRCASBP(A)-J-env成功誘導禽胚胎成纖維細胞細胞系DF-1轉(zhuǎn)化[6]。Miller A D等利用pSX2.JSRV-env成功誘導了大鼠成纖維細胞系208F轉(zhuǎn)化[7]。Johnson C等利用pLXSN-env-HA成功誘導了犬上皮細胞系MDCK的轉(zhuǎn)化[8]。研究表明，JSRV Env通常激活Ras-Raf-MEK-MAPK、RON和PI3K/Akt/mTOR這3條信號通路介導細胞轉(zhuǎn)化。Maeda N等[9]利用pCMV3GP轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞證實了JSRV通過Ras-Raf-MEK-MAPK通路對NIH3T3成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。Varela M等[10]證明了JSRV Env可以與RON酪氨酸激酶結(jié)合，且JSRV Env與透明質(zhì)酸酶-2 (hyaluronidase-2,HYAL-2)的相互作用導致RON二聚體活化。PI3K/Akt/mTOR信號通路可被生長因子、激素、蛋白激酶的受體或非受體過表達所激活，參與細胞增殖、致癌基因的轉(zhuǎn)化和癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。并且Akt可以在OPA的腫瘤細胞和JSRV Env轉(zhuǎn)化的細胞中被激活[5]。作者所在實驗室前期研究表明，通過利用pcDNA4/myc-his/exJSRV-env重組表達質(zhì)粒誘導轉(zhuǎn)化NIH3T3細胞，檢測到轉(zhuǎn)化細胞中Akt/mTOR信號通路被激活，磷酸化的Akt和mTOR水平顯著高于未轉(zhuǎn)染組，并顯著抑制了細胞自噬[11]。但目前仍需完善JSRV Env誘導細胞增殖及轉(zhuǎn)化的具體信息，以加深研究者對于JSRV Env致瘤分子機制的理解。

本研究通過已構(gòu)建好的JSRV Env慢病毒載體誘導綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細胞(sheep trophoblast cells,STCs)轉(zhuǎn)化，檢測Akt/mTOR 信號通路的激活情況，并探究細胞增殖伴隨慢病毒轉(zhuǎn)染時間延長而發(fā)生的具體變化，以期為癌基因激活細胞增殖相關(guān)信號通路提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑 DMEM high glucose、胰酶-2.5 mg/mL EDTA、FBS、青霉素-鏈霉素、無鈣鎂的磷酸鹽緩沖液，美國GIBCO公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索萊寶公司產(chǎn)品；全蛋白提取試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；BCA試劑盒，碧云天生物技術(shù)(上海)有限公司；山羊抗兔Akt，山羊抗兔 p-Akt，山羊抗兔mTOR，山羊抗兔p-mTOR，美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗鼠IgG，博奧森公司產(chǎn)品；一抗稀釋液、二抗稀釋液、ECL發(fā)光顯色試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PVDF膜，美國Millipore公司產(chǎn)品；TBST洗滌劑，北京Cwbiotech公司產(chǎn)品；脫脂奶粉，美國BD公司產(chǎn)品；雷帕霉素，美國MCE公司產(chǎn)品；MTT噻唑藍，索萊寶公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器設(shè)備 -80 ℃超低溫冰箱，青島海爾公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋,日本TOMY公司產(chǎn)品；分析天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品；微量移液器，Eppendorf，德國)；Maxi MixⅡ渦旋混勻震蕩器(Thermo，美國)；低溫高速離心機(Eppendorf，德國)；迷你離心機(Scilogex，美國)；電熱鼓風干燥箱，一恒(上海)公司產(chǎn)品；超凈工作臺,安泰蘇州有限公司產(chǎn)品；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司產(chǎn)品；多功能酶標儀，美國Biotek公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-24DN標準垂直電泳儀、迷你垂直板電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；蛋白凝膠成像系統(tǒng)，上海Tanon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細胞解凍復(fù)蘇與體外培養(yǎng) 解凍復(fù)蘇綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細胞，使用含100 mL/L血清的完全培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞在瓶內(nèi)增殖至細胞生長面70%～80%左右時傳代，待傳到解凍復(fù)蘇后的第3代、細胞體外增殖穩(wěn)定后用于后續(xù)試驗，要求細胞狀態(tài)較佳、存活率90%以上、細胞邊緣清晰。

1.2.2 JSRV過表達慢病毒及空病毒載體轉(zhuǎn)染STCs 綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔約 2×105個細胞，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，采用無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，加入5 μg的JSRV Env慢病毒，同時加入終濃度為 8 μg/mL的Polybrene增強轉(zhuǎn)染效果，24 h后更換含100 mL/L血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h后觀察細胞狀態(tài)，用激光共聚焦顯微鏡觀察是否轉(zhuǎn)染成功。

1.2.3 細胞蛋白提取及蛋白免疫印跡試驗 按照蛋白質(zhì)提取試劑盒說明書，提取細胞總蛋白，BCA法測定細胞濃度，酶標儀測定562 nm波長的吸光度值，樣品中的蛋白濃度根據(jù)標準蛋白曲線計算。蛋白中加入上樣緩沖液變性后置于-20 ℃冷藏備用。Western blot檢測目的蛋白表達量,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后，采用濕轉(zhuǎn)印法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF濾膜上，放入封閉液中封閉，室溫下置于搖床上中速封閉2 h，PVDF濾膜浸泡在10% TBST溶液中，置于搖床上10 min×5次洗膜。分別孵育一抗為山羊抗兔Akt，山羊抗兔 p-Akt，山羊抗兔mTOR，山羊抗兔p-mTOR 置于4 ℃過夜。10% TBST 10 min×5次洗膜后，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗在室溫下?lián)u床中速孵育90 min。10% TBST 10 min×5次洗膜后將ECL顯色液均勻敷在膜上，用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照觀察。利用Image J軟件分析每個條帶的灰度值，使用GraphPad Prism 8(GraphPad Sofware，USA)進行統(tǒng)計并生成統(tǒng)計圖片。

1.2.4 MTT比色法檢測細胞增殖情況 將空白組(STCs)，對照組(空病毒載體轉(zhuǎn)染STCs)，試驗組(JSRV Env慢病毒轉(zhuǎn)染STCs)的細胞消化后鋪在96孔板中，每組細胞做5個重復(fù)孔，每孔計數(shù)2 000個細胞，每孔加含100 mL/L血清的完全培養(yǎng)基200 μL，培養(yǎng)24 h后換液。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入5 mg/mL的MTT每孔20 μL，置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后吸出上清液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，振蕩溶解10 min，用酶聯(lián)免疫測定儀選擇波長為490 nm，空白孔調(diào)零，測定各孔吸光值，取其平均吸光值，以細胞生長變化率表示，以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制細胞增殖曲線圖，使用GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計，P<0.05具有統(tǒng)計學意義，并生成統(tǒng)計圖片。

1.2.5 JSRV Env過表達慢病毒轉(zhuǎn)染STCs并加入雷帕霉素 JSRV Env慢病毒轉(zhuǎn)染24 h后，添加50 μmol/L雷帕霉素作用12、48、72 h。Western blot檢測mTOR表達情況。MTT比色法檢測細胞增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 JSRV Env慢病毒感染STCs細胞

利用激光共聚焦顯微鏡觀察空白組(STCs)、對照組(空病毒載體轉(zhuǎn)染STCs)、試驗組(JSRV Env慢病毒轉(zhuǎn)染STCs)的熒光表達情況。JSRV Env慢病毒轉(zhuǎn)染STCs 72 h后，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到大量的紅色熒光信號說明Env蛋白大量表達，占比約為80%，證明JSRV Env慢病毒轉(zhuǎn)染成功(圖1)。

A.激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果；B.JSRV Env慢病毒轉(zhuǎn)染STCs 72 h相對熒光蛋白表達率分析結(jié)果;a.明場下STCs未轉(zhuǎn)染組；b.熒光場下STCs未轉(zhuǎn)染組；c.明場下慢病毒空載體轉(zhuǎn)染STCs；d.熒光場下慢病毒空載體轉(zhuǎn)染STCs；e.明場下JSRV Env過表達慢病毒轉(zhuǎn)染STCs；f.熒光場下JSRV Env慢病毒轉(zhuǎn)染STCs。

2.2 Western blot檢測STCs細胞中Akt/mTOR信號通路蛋白表達量

與蛋白預(yù)染Marker相比較，在60 ku處及289 ku表達明顯蛋白條帶?？瞻捉M，對照組，試驗組中均有Akt、mTOR的表達，試驗組中有p-Akt、p-mTOR的大量表達。經(jīng)過灰度分析處理，p-Akt、p-mTOR在JSRV Env慢病毒感染組的表達水平顯著高于未轉(zhuǎn)染組的磷酸化水平(P<0.05)(圖2)。說明了在JSRV Env慢病毒作用下成功激活A(yù)kt/mTOR信號通路。

圖2 STCs中Akt、mTOR蛋白免疫印跡鑒定

2.3 Western blot檢測加入雷帕霉素后的mTOR表達量

為探究雷帕霉素對mTOR的抑制作用 ，利用Western blot檢測試驗組(JSRV Env慢病毒轉(zhuǎn)染組)加入雷帕霉素24、48、72 h后mTOR表達量。

結(jié)果顯示，與24 h和48 h相比，雷帕霉素作用72 h后mTOR表達量顯著減少(P<0.05)，24 h和48 h之間無顯著差異(P>0.05)。說明了雷帕霉素抑制了mTOR的表達(圖3)。

圖3 雷帕霉素抑制mTOR蛋白免疫印跡及分析

2.4 MTT測定細胞增殖

為探究JSRV Env慢病毒對STCs增殖的影響，利用MTT比色法測定空白組(STCs)，對照組(空病毒載體轉(zhuǎn)染STCs)，試驗組(JSRV Env慢病毒轉(zhuǎn)染STCs)，雷帕霉素抑制組24、48、72 h的光吸收值。結(jié)果顯示，試驗組在各個時間段的光吸收值均大于空白組及對照組，在72 h光吸收值差異顯著(P<0.05)，空白組和對照組之間無顯著差異(P>0.05)；雷帕霉素抑制組在各個時間段的光吸收值顯著(P<0.05)低于其他3組(圖4)。以上結(jié)果表明，JSRV Env轉(zhuǎn)化STCs后促進了細胞增殖，mTOR抑制劑雷帕霉素抑制了細胞增殖。

圖4 MTT法測定JSRV Env慢病毒感染STCs細胞增殖

3 討論

本研究利用JSRV Env慢病毒載體誘導STCs轉(zhuǎn)化，探究Akt/mTOR信號通路的激活和對細胞周期的影響。JSRV Env體外誘導試驗通常采用真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式，本試驗通過慢病毒將外源基因整合到宿主染色體中，進行高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導。其長末端重復(fù)序列(Long terminal repeats,LTR)具有啟動子和增強子等調(diào)控元件，可以提高病毒基因的表達能力，并且極大地還原了JSRV-env在體內(nèi)作用的條件[12]。該方法對探究JSRV Env影響細胞增殖有重要意義。

JSRV Env通?？梢鹕掀ぜ毎l(fā)生轉(zhuǎn)化，在綿羊體內(nèi)主要感染肺泡Ⅱ型上皮細胞和克拉拉細胞，本試驗中采用綿羊源分泌型上皮細胞——綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細胞進行研究，使JSRV Env轉(zhuǎn)化細胞的方式與綿羊肺腺瘤病的惡性轉(zhuǎn)化細胞機制更為接近。Env主要通過受體依賴機制激活A(yù)kt/mTOR信號通路，即JSRV Env與細胞膜表面的受體Hyal 2結(jié)合，激活了磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3′-kinase-serine，PI3K)及下游的Akt和mTOR。已有研究表明JSRV Env轉(zhuǎn)化細胞途徑依賴于該機制的還有人支氣管上皮細胞BEAS-2B[13]、大鼠回腸上皮細胞IEC-18[7]和大鼠腎上皮細胞RK3E[9]等。

本實驗室前期的試驗結(jié)果驗證了MAPK信號轉(zhuǎn)導通路中的JNK信號通路、P38信號通路、ERK信號通路在OPA病肺中激活，通過通路關(guān)聯(lián)交叉參與細胞凋亡、自噬、增殖等生理過程影響細胞周期[5]。本試驗驗證了JSRV Env轉(zhuǎn)化細胞中激活A(yù)kt/mTOR 信號轉(zhuǎn)導通路，并且與細胞周期密切相關(guān)，Akt/mTOR途徑對JSRV轉(zhuǎn)化細胞非常重要。作者所在實驗室轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果也揭示該信號通路在OPA中激活[14]。利用JSRV-env體外過表達也成功驗證Akt/mTOR信號通路激活[11]。本課題組孫曉林等[5]利用pcDNA4/myc-his/exJSRV-env成功驗證了Akt/mTOR信號通路在NIH3T3細胞中被激活。Maeda N等[9]利用pCMV3GP轉(zhuǎn)染大鼠腎上皮細胞系RK3E和小鼠成纖維細胞系NIH3T3，證實了JSRV-env過表達激活A(yù)kt/mTOR信號通路，且對RK3E細胞調(diào)控作用更明顯。Liu 利用Jenv-FLAG (JSRV Env)成功轉(zhuǎn)化了大鼠成纖維細胞系208F，驗證了Akt/mTOR信號通路激活[15]。作者所在實驗室杜方原利用pcDNA4/myc-his/exJSRV-env重組表達質(zhì)粒誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化利用CCK-8法檢測到細胞增殖活力增強[16]。以上結(jié)果均與本試驗結(jié)果一致。

本試驗結(jié)果表明JSRV Env轉(zhuǎn)化STCs后激活了Akt/mTOR信號通路，促進了細胞增殖。而在加入mTOR抑制劑雷帕霉素后，抑制了細胞增殖。即JSRV Env通過Akt/mTOR信號通路轉(zhuǎn)化細胞調(diào)控細胞的增殖，彌補了前人研究的空白。

基于以上研究明確Akt/mTOR 信號通路在JSRV Env轉(zhuǎn)化中的重要性，其具體轉(zhuǎn)化機制有待后續(xù)更深入的研究。

JSRV Env轉(zhuǎn)化STCs后，通過激活A(yù)kt/mTOR 信號通路促進了細胞增殖。本研究結(jié)果進一步完善了細胞增殖的基礎(chǔ)研究資料。