張燕燕，王靖雷，潘陽(yáng)陽(yáng)，馬文斌，高麗青，張 輝，李心蕊，余四九，徐庚全

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730070)

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)的化學(xué)名稱(chēng)為1-脂酰甘油-3-磷酸酯，是一種最簡(jiǎn)單的小分子甘油磷脂，同時(shí)也是最有效的水溶性脂質(zhì)信號(hào)分子之一。到目前為止，已經(jīng)表明LPA既可以作為磷脂合成的中間體在細(xì)胞內(nèi)合成，也可以在細(xì)胞外作為細(xì)胞間信號(hào)分子合成[1]。已在各種生物體液中檢測(cè)到LPA的存在，如人和牛血清和血漿、人唾液、腹水、卵泡液、大鼠精漿、牛子宮內(nèi)膜和卵巢黃體細(xì)胞[2]，以及人卵巢和宮頸癌細(xì)胞。LPA是脂源性G-蛋白藕聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor,GPCR)的激動(dòng)劑，能促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化以及提高細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用[3]，參與細(xì)胞骨架的重新分布以及腫瘤形成和侵襲等多種病理生理過(guò)程。

LPA生物學(xué)作用至少由6種高親和力跨膜G蛋白偶聯(lián)受體LPAR1-LPAR6誘導(dǎo)其活性[4]，可能通過(guò)核過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體G[1]。這些膜受體由不同的基因編碼，在人類(lèi)和小鼠中分為L(zhǎng)PAR1-6和Lpar1-6[5]。LPAR在人、牛、羊、豬和嚙齒動(dòng)物等物種之間顯示出高度的同源性。LPA在人體血清中的濃度10 mmol/L～15 mmol/L[6]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)激活LPAR1-5所需的表觀納米分子Kd值[5]，提示LPARs在生理功能中的重要性。還有研究發(fā)現(xiàn)，LPAR在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)受類(lèi)固醇激素的調(diào)節(jié)，包括孕酮(progesterone,P4)和雌二醇(estradiol,E2)[7-8]。對(duì)卵巢摘除小鼠的研究表明，P4促進(jìn)了LPAR3的表達(dá)，而雌激素則抵消了P4的影響[8]。作者推測(cè)P4和E2共同調(diào)節(jié)LPAR3的表達(dá)，有助于早孕子宮內(nèi)膜的容受性。在牛的卵丘細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的LPAR1-4轉(zhuǎn)錄本豐度，而在卵母細(xì)胞中，LPAR2的表達(dá)高于其他3個(gè)LPARs[9]。在綿羊中，Liszewska E等[10]發(fā)現(xiàn)LPAR1-3轉(zhuǎn)錄本在妊娠早期胚胎的滋養(yǎng)外胚層提取物中表達(dá)。此外，Van Meeteren L A等[11]在小鼠移植后的第6.5天到第10.5天胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)4個(gè)LPAR的mRNA表達(dá)。LPAR通過(guò)在器官和組織中的不同分布以及與不同的異三聚體G蛋白的結(jié)合，能夠激活不同的下游信號(hào)通路，從而引起基因調(diào)控和LPA誘導(dǎo)的細(xì)胞功能的改變[7]。上述研究表明，LPAR在許多哺乳動(dòng)物生殖生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，但在牦牛上還未見(jiàn)報(bào)道。

牦牛(Bosgrunniens)主要棲息地具有高寒、缺氧、高輻射和植物生長(zhǎng)季節(jié)短的環(huán)境特征[12]，是高原畜牧業(yè)的主要畜種，也是我國(guó)高寒牧區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源。但是因其生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，繁殖性能低，是制約當(dāng)前牦牛業(yè)發(fā)展的重要原因。因此，探究LPA受體在雌性牦牛生殖中的作用，在提高牦牛生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本試驗(yàn)以牦牛不同發(fā)情時(shí)期卵巢為材料，利用RT-qPCR、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)等方法檢測(cè)牦牛生殖系統(tǒng)中LPAR1、LPAR2、LPAR3的表達(dá)及定位，可為進(jìn)一步研究牦牛生殖生理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DAB顯色液、顯/定影液、BeyoEcLPLus液，Beyotime公司產(chǎn)品； Tranzol試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TaqPCR Master Mix、Go ScriptTMReverse Transcription System、Wizard?SVd Gel and PCR Clean-Up System，美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；TB Green?Premix ExTaqTM Ⅱ，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；4×蛋白上樣緩沖液、Western blot所用試劑，索萊寶(北京)有限公司產(chǎn)品、HistostainTM-Plus Kits、Goat Anti-Rab-bit IgG/HRP antibody，Rabbit Anti-LPA1-3 Polyclonal Antibody，北京Bioss公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 PCR儀(eppendorf),德國(guó)艾本德公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler?96 SW 1.1),瑞士Loch1公司產(chǎn)品；陽(yáng)離子防脫片,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；顯微鏡(DP71),日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.1.3 樣品 2019年11月采自青海省西寧市百德屠宰場(chǎng)，選年齡相近，處于不同繁殖時(shí)期(卵泡期,黃體期和妊娠期)的健康成年雌性牦牛(Bosgrunniens)各3頭。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 牦牛處死后，采集卵泡期(卵巢上見(jiàn)成熟卵泡)、黃體期(見(jiàn)新鮮黃體)同側(cè)，以及妊娠期(見(jiàn)胚胎存在)妊娠側(cè)的卵巢，將采集到的樣品修剪后用9 g/L的生理鹽水沖洗干凈，分成2份，1份液氮保存后送回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃條件儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ａ?份樣品修剪至約1 cm3大小后，于40 mg/mL多聚甲醛溶液中帶回實(shí)驗(yàn)室，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)LPAR1-3基因的表達(dá)

1.2.2.1 牦牛不同時(shí)期卵巢總RNA提取 參照Trizol試劑盒其說(shuō)明書(shū)將牦牛不同時(shí)期卵巢(卵泡期、黃體期、妊娠期)低溫研磨后提取總RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和OD260/OD280值，兩步法反轉(zhuǎn)錄(Go ScriptT M Reverse Tran-scription Syatem,Promega)合成cDNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2LPAR1-3基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 根據(jù)GenBank公布的普通牛LPAR1、LPAR2、LPAR3基因編碼區(qū)，在NCBI Primer-Blast中設(shè)計(jì)，試驗(yàn)選擇β-actin(肌動(dòng)蛋白)為內(nèi)參基因，本試驗(yàn)所涉及引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，具體引物信息見(jiàn)表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LPAR1、LPAR2、LPAR3基因在牦牛不同時(shí)期卵巢中的表達(dá)情況。PCR總反應(yīng)體系20 μL：TB Green?Premix ExTaqTMⅡ 10μL，無(wú)菌去離子水6.4 μL，cDNA(500 ng/μL) 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95℃ 5s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。LightCycler/LightCy-cler480 System(Roche Diagnostics,德國(guó))，每組重復(fù)4次(n=4)。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量熔解曲線判斷引物特異性，根據(jù)每個(gè)樣品的Cq值，經(jīng)2-ΔΔCq計(jì)算LPAR1、LPAR2、LPAR3基因在牦牛不同時(shí)期卵巢中的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western blot檢測(cè)LPAR1-3蛋白的表達(dá)

1.2.3.1 制備牦牛組織蛋白質(zhì)樣品 將牦牛不同時(shí)期卵巢組織樣品低溫研磨碎后，稱(chēng)取一定量加入蛋白裂解液(按裂解液(radio immunoprecipita-tion assa,RIPA)∶蛋白酶抑制劑(phenylmethanesul-fonyl fluoride,PMSF)= 100∶1配制)冰上反應(yīng)，待組織充分裂解后 4 ℃、12 000 r/min離心5 min，吸出上清液，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 Western blot 將蛋白樣品與4×蛋白上樣緩沖液按3∶1混合，100 ℃ 10 min金屬浴變性后-20 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。SDS-PAGE凝膠電泳，LPAR1、LPAR3配制80 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠，LPAR2配制100 g/L和50 g/L濃縮膠，變性蛋白經(jīng)電泳分離后，根據(jù)LPAR蛋白大小(LPAR1：41 ku，LPAR2：39 ku，LPAR3:39 ku)切膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜(polyvinylidene fluoride)上，LPAR1在4 ℃的冰箱用50 g/L脫脂奶粉封閉7 h；LPAR2在常溫用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h；LPAR3在4 ℃的冰箱用50 g/L脫脂奶粉封閉過(guò)夜(12 h)；一抗Rabbit Anti-LPA1 Polyclonal Antibody (1∶600稀釋)中4 ℃孵育過(guò)夜；一抗Rabbit Anti-LPA2 Polyclonal Antibody (1∶1 000稀釋)中4 ℃孵育過(guò)夜；一抗Rabbit Anti-LPA3 Polyclonal Antibody (1∶1 200稀釋)中4 ℃孵育過(guò)夜，PBST(磷酸鹽緩沖液(PBS)+Tween 20)浸洗30 min后，二抗Goat Anti-Rabbit IgG/HRP antibody (1∶1 000稀釋)中室溫孵育40 min；PBST浸洗膜3次，每次20 min。在膜上滴加電化學(xué)發(fā)光液(elec-tro-chemi- luminescence,ECL)，GEAI600成像系統(tǒng)掃描目的條帶，利用Image J分析灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量(目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值)。

1.2.4 免疫組化法對(duì)LPA受體蛋白分布進(jìn)行定位 選取用固定后的卵巢組織塊，上行酒精脫水，石蠟包埋，切片，下行脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，在檸檬酸鹽緩沖液中熱誘導(dǎo)，高火煮沸后轉(zhuǎn)中火10 min，室溫自然冷卻。參照Histostai TM-Plus Kits試劑盒說(shuō)明，滴加30 mL/L H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，37 ℃作用10 min；將組織周?chē)粮珊蟮渭臃忾]液(A液)減少非特異性背景，室溫濕盒孵育15 min；滴加一抗Rabbit Anti-LPA1-3 Polyclonal Antibody (1∶500稀釋)，添加對(duì)照組(PBS代替一抗)，4 ℃濕盒孵育過(guò)夜；滴加二抗(B液)，37 ℃濕盒孵育10 min；滴加C液，37 ℃溫箱濕盒孵育15 min；加二氨基聯(lián)苯胺顯色液(diaminob-enzidine,DAB)顯色，蘇木精復(fù)染90 s、脫水、透明、樹(shù)脂封片，室溫晾干后Olympus(DP71)拍照系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 LPAR1-3基因檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)LPAR1、LPAR2、LPAR3在不同時(shí)期卵巢中的表達(dá)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，LPAR1-3基因在不同時(shí)期卵巢中均有表達(dá)(圖1)，在不同時(shí)期卵巢中,LPAR1基因在卵泡期卵巢中的表達(dá)量顯著高于黃體期和妊娠期(P<0.05)，黃體期和妊娠期表達(dá)量相似(圖1A)；LPAR2在卵泡期卵巢中的表達(dá)量最高，顯著高于黃體期(P<0.05),妊娠期的表達(dá)量最低(圖1B)；LPAR3在黃體期卵巢中表達(dá)量最高，顯著高于卵泡期(P<0.05),妊娠期的表達(dá)量最低(圖1C),在同一時(shí)期卵巢中：LPAR1在卵泡期、黃體期、妊娠期的表達(dá)量均顯著高于LPAR2和LPAR3(P<0.05)；其中，LPAR3在卵泡期表達(dá)量最低(圖1D)，LPAR2在黃體期和妊娠期的表達(dá)量均最低(圖1E和圖1F)。結(jié)果說(shuō)明LPAR1-3在不同繁殖時(shí)期牦牛卵巢中的表達(dá)存在差異。

2.2 LPAR1-3蛋白檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)Western blot檢測(cè)LPAR1、LPAR2、LPAR3蛋白在不同時(shí)期卵巢中的表達(dá)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，LPAR1-3蛋白在不同時(shí)期卵巢中均有表達(dá)(圖2)，在不同時(shí)期卵巢中, LPAR1、LPAR2、LPAR3蛋白的表達(dá)量均在妊娠期最高，均顯著高于黃體期(P<0.05)，并且在卵泡期表達(dá)量均最低(圖3A、B、C)。在同一時(shí)期卵巢中,LPAR3蛋白在卵泡期、黃體期、妊娠期的表達(dá)量均顯著高于LPAR1和LPAR2(P<0.05)，LPAR2的表達(dá)量最低(圖D3、E、F)。結(jié)果說(shuō)明LPAR1-3蛋白在不同繁殖時(shí)期牦牛卵巢中的表達(dá)存在差異，且在各個(gè)時(shí)期中LPAR3表達(dá)量最高。

內(nèi)參基因：β-actin；n=4。A.LPAR1；B.LPAR2；C.LPAR3；D.卵泡期；E.黃體期；F.妊娠期；不同字母代表差異顯著(P<0.05)

1.卵泡期；2.黃體期；3.妊娠期

2.3 LPAR1-3蛋白定位檢測(cè)結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果中呈棕褐色的為陽(yáng)性表達(dá)，與之對(duì)應(yīng)的是陰性對(duì)照(圖4)。結(jié)果顯示，LPAR1、LPAR2、LPAR3蛋白在牦牛不同時(shí)期卵巢上均有表達(dá)，LPAR1-3在卵泡期卵巢上的表達(dá)主要分布在卵泡顆粒層(SG)、卵泡膜(TF)、生殖上皮(GE)、卵泡液(FF)；LPAR1-3在黃體期卵巢上的表達(dá)主要在黃體細(xì)胞(CL)、生殖上皮(GE)；LPAR1-3在妊娠期期卵巢上的表達(dá)主要在卵泡顆粒層(SG)、卵泡膜(TF)、黃體細(xì)胞(CL)、生殖上皮(GE)、卵泡液(FF)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，不同時(shí)期卵巢中LPAR1、LPAR2、LPAR3的mRNA和蛋白豐度不存在相關(guān)性。轉(zhuǎn)錄和翻譯遠(yuǎn)不是線性的、簡(jiǎn)單的關(guān)系。據(jù)報(bào)道，調(diào)節(jié)蛋白通過(guò)在與SD序列相鄰的區(qū)域與其自身的mRNA結(jié)合來(lái)抑制某些順?lè)醋拥姆g[13]。同時(shí)，SD序列還決定翻譯效率，具有較少SD序列的轉(zhuǎn)錄本翻譯效率較低，翻譯效率會(huì)顯著改變部分基因mRNA與蛋白質(zhì)的相關(guān)性[14]。同時(shí)研究人員在不同的機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，sRNA會(huì)影響mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性，有些促進(jìn)核糖體與靶mRNA結(jié)合，有些則阻止翻譯[15]、影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或翻譯水平進(jìn)而導(dǎo)致mRNA和蛋白量無(wú)相關(guān)性[16]。此外，Liszewska E等[10]發(fā)現(xiàn)在綿羊滋養(yǎng)外胚層中LPAR1和LPAR3的mRNA豐度在第14天達(dá)到高峰，而這兩種LPAR的蛋白水平在妊娠第17天達(dá)到最高，先前報(bào)道的綿羊胚胎滋養(yǎng)外胚層分泌的主要產(chǎn)物即干擾素，在蛋白表達(dá)高峰和轉(zhuǎn)錄物之間有相似的時(shí)間間隔。胚胎干擾素mRNA在第14天最豐富，而干擾素蛋白在第16～第18天達(dá)到最高水平，幾乎檢測(cè)不到RNA。說(shuō)明干擾素可能在一定程度上影響mRNA和蛋白量的相關(guān)性[17]。綜上所述，轉(zhuǎn)錄和翻譯涉及順式作用機(jī)制和反式作用機(jī)制的不同機(jī)制產(chǎn)生了大量的系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以促進(jìn)或抑制從一定數(shù)量的mRNA分子合成蛋白質(zhì)。此外，不同時(shí)期卵巢中LPAR的mRNA和蛋白表達(dá)可能受到某種因子的調(diào)控作用。

內(nèi)參蛋白：β-actin；n=4。A.LPAR1；B.LPAR2；C.LPAR3；D.卵泡期；E.黃體期；F.妊娠期；不同字母代表差異顯著(P<0.05)

卵巢是雌性動(dòng)物的主要生殖器官，不僅產(chǎn)生卵子和排卵，還可以產(chǎn)生性激素(包括雌激素、孕激素和少量的雄性激素)以及分泌一些多肽激素和生長(zhǎng)因子，在生殖器官上占有主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示LPAR1-3在牦牛的不同時(shí)期的卵巢上均有表達(dá)。主要分布在卵巢生殖上皮、顆粒細(xì)胞、卵泡液、卵泡膜和黃體細(xì)胞。Chen S U等[18]發(fā)現(xiàn)LPAR1-3受體在人顆粒黃體細(xì)胞中表達(dá)，并且有文獻(xiàn)報(bào)道在牛卵巢中的黃體[2]和卵泡顆粒細(xì)胞[19]中檢測(cè)到4種LPAR的表達(dá)。此外，在從接受體外受精的婦女的卵泡液中也發(fā)現(xiàn)了LPA[20]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。在牛體中，顆粒細(xì)胞是E2的主要來(lái)源和靶點(diǎn)[21-23]，膜來(lái)源的雄烯二酮(A4)在類(lèi)固醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為E2[22]。此外，LPA也可刺激E2的產(chǎn)生，E2是通過(guò)調(diào)節(jié)類(lèi)固醇的產(chǎn)生和促性腺激素受體的表達(dá)來(lái)促進(jìn)卵泡發(fā)育[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPAR1-3在卵泡顆粒層和卵泡膜表達(dá)，可能與LPAR1-3參與卵巢上皮前體顆粒細(xì)胞增殖和分化有關(guān)，提示LPAR1-3可能通過(guò)調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和卵泡閉鎖過(guò)程影響牦牛生育能力。有研究表明，補(bǔ)充LPA的體外成熟培養(yǎng)液可以提高卵母細(xì)胞的成熟率[23]。此外，在LPA存在下，豬和牛卵母細(xì)胞的成熟率也有不同程度的提高[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPAR1-3在卵巢的卵泡液中表達(dá)，可能與參與卵母細(xì)胞成熟和功能的調(diào)控作用有關(guān)。有報(bào)道稱(chēng)，LPA通過(guò)增加3b-羥基類(lèi)固醇脫氫酶/5D-4D異構(gòu)酶在牛黃體類(lèi)固醇生成細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)刺激P4的合成[2]，P4是一種天然孕激素，促進(jìn)子宮內(nèi)膜分泌，以利受精卵的植入，并降低子宮內(nèi)膜的興奮性，保證妊娠的安全進(jìn)行。本研究發(fā)現(xiàn)，LPAR1-3在卵泡液中均表達(dá)，推測(cè)LPAR1-3可能參與牦牛胚胎植入和妊娠的維持。

卵泡的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟是提高繁殖力的關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)，LPA可通過(guò)LPA受體誘導(dǎo)白介素細(xì)胞8(interleukin-8,IL-8)和白介素細(xì)胞6(interleukin-6,IL-6)的表達(dá)[18]。IL-8和IL-6已被發(fā)現(xiàn)在排卵前卵泡中升高，并與排卵有關(guān)。IL-8和IL-6可能具有白細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化活性，這可能通過(guò)蛋白水解因子的釋放導(dǎo)致卵泡破裂時(shí)的組織降解[25]。此外，IL-8參與卵泡發(fā)育、排卵、類(lèi)固醇生成和黃體功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，卵泡期LPAR1-3均表達(dá)，且LPAR3顯著高于LPAR1、LPAR2，因此，卵泡期卵巢中LPAR1-3的存在可能在牦牛卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育以及排卵中起一定的作用。

黃體是一種在卵巢中暫時(shí)形成的內(nèi)分泌腺，在發(fā)情周期結(jié)束時(shí)經(jīng)歷退化。黃體由成熟卵泡形成，生長(zhǎng)迅速，血管化迅速。牛黃體由大小黃體細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成。在未懷孕的奶牛中，黃體在排卵后17 d～18 d左右經(jīng)歷黃體溶解并失去功能[26]。黃體生成高峰和排卵后，黃體顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞形成黃體新生血管[27]。新生血管可能促進(jìn)類(lèi)固醇激素的生物合成和運(yùn)輸。有報(bào)道稱(chēng)，LPAR1參與了LPA誘導(dǎo)的IL-8蛋白在血管生成中內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、通透性、管形成和增殖的過(guò)程。而LPAR2參與了LPA誘導(dǎo)的IL-6蛋白在功能上增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[18]。綜上所述，LPAR1、LPAR2可能在LPA的誘導(dǎo)下參與牦牛黃體新生血管的形成。

妊娠期卵巢會(huì)稍微有所增大，同時(shí)停止排卵，一側(cè)卵巢可以看到有妊娠黃體的形成，妊娠黃體是用來(lái)合成雌激素和孕激素的。黃體在妊娠期間的主要功能是合成P4，它在調(diào)節(jié)受精后胚泡的植入中起主要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPAR1-3在妊娠期卵巢均表達(dá)，可能與LPAR1-3參與調(diào)節(jié)受精后胚泡的植入有關(guān)。在摘除卵巢的小鼠中P4也促進(jìn)了LPAR3的表達(dá)，而雌激素則抵消了P4的影響[8]，作者推測(cè)P4和E2共同調(diào)節(jié)LPAR3的表達(dá)，有助于早孕子宮內(nèi)膜的容受性。此外，Ye X等[28]發(fā)現(xiàn)LPAR3在小鼠子宮中的表達(dá)與正確的胚胎植入有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPAR3在妊娠期表達(dá)量顯著高于LPAR1和LPAR2,LPAR3可能通過(guò)P4促進(jìn)子宮內(nèi)膜分泌，并降低子宮內(nèi)膜的興奮性，保證妊娠的安全進(jìn)行,提示LPAR3可能在牦牛的胚胎的植入和妊娠的維持具有一定的作用。