盛靜宇朱海根?王 麗

(1.江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院 徐州醫(yī)科大學(xué)武進(jìn)臨床學(xué)院心電學(xué)科,江蘇 常州 213000;2.江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院 徐州醫(yī)科大學(xué)武進(jìn)臨床學(xué)院全科醫(yī)學(xué)科,江蘇 常州 213000;3.常州德安醫(yī)院院感科,江蘇 常州 213000)

心血管疾病作為全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病給患者健康帶來了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[1]。據(jù)目前研究所知,心血管疾病潛在的病理變化主要包括心臟衰竭、心肌梗死、心房顫動(dòng)、動(dòng)脈粥樣硬化和缺血再灌注[2]。值得注意的是,心肌梗死是威脅人類健康和導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的主要因素之一[3]。研究發(fā)現(xiàn),在心肌梗死的過程中,心肌細(xì)胞會在相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)遭受缺血缺氧導(dǎo)致的不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞死亡或心功能不全[4]。減少心肌細(xì)胞凋亡和損傷可以明顯改善心功能和心臟重構(gòu)。因此,保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡在抑制心血管疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類長度約為18~24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子,可以通過靶向結(jié)合含有部分互補(bǔ)序列的mRNA的3’非編碼區(qū)(3’UTR)端而對mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控,進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)功能[5-7]。越來越多的研究表明miRNAs在多種心臟疾病中發(fā)揮重要作用[8-10]。miR-433-3p是位于12號染色體上的抑癌基因,可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥[11-12]。除腫瘤細(xì)胞外,心肌中miR-433-3p可以通過靶向調(diào)節(jié)有絲分裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)影響心肌纖維化的進(jìn)程[13]。但miR-433-4p是否能夠通過MAPK8調(diào)控在心血管疾病中發(fā)揮作用還尚未報(bào)道。在本研究中,我們將心肌細(xì)胞H9c2暴露于過氧化氫(H2O2)刺激中以模擬氧化應(yīng)激引起的心肌損傷,并探討miR-433-3p在H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2損傷中的作用及潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

大鼠心肌細(xì)胞H9c2購買于中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(批號:A4192101)、胎牛血清FBS(批號:15140163)、青霉素和鏈霉素(批號:15140-122)(美國Gibco公司);MTT檢測試劑盒(批號:ST316)、乳酸脫氫酶ELISA活性檢測試劑盒(批號:C0016);全蛋白提取試劑盒(批號:P0033)、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(批號:P0012S)(上海碧云天生物公司);miR-433-3p模擬物miR-433-3p mimics、miRNA陰性對照miRNC、MAPK8過表達(dá)載體pcDNA-MAPK8、陰性對照pcDNA-NC(上海吉瑪制藥有限公司);Bcl-2抗體(批號:2875)、Bax抗體(批號:14796)、Caspase-3抗體(批號:9662)、Cealve Caspase-3抗體(批號:9661)、MAPK8抗體(批號:9255)、GAPDH抗體(批號:5174)、羊抗兔二抗(批號:2985S)(美國Cell Signaling Technology公司);SYBR Green qPCR試劑盒(批號:RR420A)(大連TaKaRa公司);轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(批號:11668027)(美國Invitrogen公司);雙熒光素酶檢測試劑盒(批號:C8304)(美國Promega公司);酶標(biāo)儀(批號:MB16-414)(上海皓莊儀器公司);倒置相差顯微鏡(批號:STM7)(日本奧林巴斯公司);蛋白凝膠成像儀(批號:Bio6000)(中晶有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

將H9c2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃、95%空氣和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。每48 h更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞按照每毫升3×103個(gè)的密度接種于96孔板24 h后,分別加入0、25、50、100、200 μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用MTT法檢測H2O2對心肌細(xì)胞H9c2活力的影響并篩選出最合適的H2O2濃度。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

當(dāng)H9c2細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時(shí)用胰蛋白酶消化細(xì)胞,并按照每毫升2×105個(gè)的密度將細(xì)胞接種到6孔板中。待細(xì)胞生長密度達(dá)到70%時(shí),用200 μmol/L的H2O2處理24 h。隨后采用Lipofectamine 2000將miR-NC(miRNA陰性對照組),miR-433-3p mimics(miR-433-3p模擬物組),miR-433-3p mimics與pcDNA-NC(miR-433-3p模擬物+pcDNA陰性對照組),miR-433-3p mimics與pcDNA-MAPK8(miR-433-3p模擬物+MAPK8過表達(dá)組)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)48 h,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞活力

取轉(zhuǎn)染48 h后的H9c2細(xì)胞按照每毫升1×104個(gè)的密度接種于96孔板中。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后。每孔加入終濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL,孵育4 h后倒掉上清,加入150 μL的二甲基亞砜室溫孵育10 min。采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在570 nm時(shí)檢測各孔的OD值。

1.3.4 ELISA檢測LDH水平

根據(jù)1.3.2的方法對細(xì)胞進(jìn)行分組后,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的操作說明檢測H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平。

1.3.5 qRT-PCR檢測miR-433-3p和MAPK8的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞,用PBS清洗細(xì)胞后,采用TRIzol溶液提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板嚴(yán)格按照SYBR Green qPCR試劑盒標(biāo)準(zhǔn)說明書分別進(jìn)行目的基因的熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性15 s,60℃退火30 s,共計(jì)45個(gè)循。以GAPDH或U6作為內(nèi)參并采用2-△△Ct法計(jì)算miR-433-3p和MAPK8的相對表達(dá)量。其中所使用的引物詳見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.6 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞,用PBS清洗細(xì)胞后,采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA濃度檢測試劑盒對蛋白提取物進(jìn)行定量。每孔20 μg上樣量,通過12% SDS-PAGE分離蛋白,將蛋白印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜,用5%脫脂奶封膜2 h,加入標(biāo)記一抗4℃孵育過夜,PBS清洗PVDF膜后在加入標(biāo)記二抗孵育1 h。加ECL顯影液進(jìn)行顯影。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

采用miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)網(wǎng)站預(yù)測miR-433-3p和MAPK8的靶向作用位點(diǎn)。構(gòu)建野生型和突變型的MAPK8 3’UTR區(qū)域的重組質(zhì)粒,分別與miR-433-3p或miR-NC共轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞。48 h后嚴(yán)格按照雙熒光素酶檢測試劑盒檢測細(xì)胞中熒光素酶的活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 18.0分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。兩組之間比較采用t檢驗(yàn),多組之間比較采用單因素方差分析。P<0.05被認(rèn)為差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-433-3p在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中低表達(dá)

采用H2O2構(gòu)建心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。0、25、50、100、200 μmol/L的H2O2處理H9c2細(xì)胞48 h后,MTT檢測結(jié)果顯示,相對比對照組,隨著H2O2濃度的增加,H9c2細(xì)胞活力逐漸減少,且有顯著性差異(P<0.001,圖1A)。在H2O2濃度為200 μmol/L時(shí),細(xì)胞活力下降為初始值的50%。因此選擇該濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的H2O2誘導(dǎo)劑量。接下來,我們采用qRT-PCR法檢測miR-433-3p在H9c2細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平,H2O2組miR-433-3p表達(dá)水平比對照組顯著減少;與H2O2+miR-NC組相比,轉(zhuǎn)染了miR-433-3p mimics的細(xì)胞中miR-433-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.01,圖1B)。表明miR-433-3p過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 miR-433-3p過表達(dá)減輕了H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2活性損傷

注:A:MTT檢測不同劑量的H2O2對H9c2細(xì)胞活力的影響;B:qRT-PCR檢測H2O2處理下的H9c2細(xì)胞中miR-433-3p表達(dá)水平的變化。1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miRNC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組。與0 μmol/L組比,???P<0.001;與對照組比較,###P<0.001;與H2O2+miR-NC組比較,ΔΔP<0.01。圖1 miR-433-3p在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中低表達(dá)Note.A,Cell viabilities of H9c2 cells exposed to different doses of H2O2weredeterminedwith MTT assay.B,Levelsof miR-433-3p in H9c2 cells treated with H2O2 were detected by qRT-PCR.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.Compared with 0 μmol/L group,???P<0.001.Compared with control group,###P<0.001.Compared with H2O2+miR-NC group,ΔΔP<0.01.Figure 1 Level of miR-433-3p was downregulated in H9c2 cardiomyocytes treated with H2O2

與對照組相比,H2O2組H9c2細(xì)胞中的LDH釋放量顯著升高;與H2O2+miR-NC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics組H9c2細(xì)胞中的LDH釋放量顯著降低(均P<0.001,圖2A)。與對照組相比,H2O2組的H9c2細(xì)胞活性顯著降低;與H2O2+miRNC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics組的H9c2細(xì)胞活性顯著升高(均P<0.01,圖2B)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-433-3p過表達(dá)可以明顯減輕細(xì)胞活性損傷。

2.3 miR-433-3p過表達(dá)抑制了H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡

與對照組相比,H2O2組H9c2細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平顯著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著降低;與H2O2+miRNC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics組H9c2細(xì)胞中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01,圖3)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-433-3p過表達(dá)抑制了H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡。

2.4 miR-433-3p負(fù)靶向調(diào)控MAPK8的表達(dá)

通過miRDB在線生物信息網(wǎng)站分析,miR-433-3p可以與MAPK8的3’UTR相結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明在MAPK8野生型表達(dá)的H9c2細(xì)胞中,與miR-NC組相比,miR-433-3p mimics組的熒光素酶活性顯著下降(P<0.001,圖4A)。與miRNC組相比,miR-433-3p過表達(dá)能顯著抑制MAPK8的mRNA表達(dá)水平(P<0.001,圖4B)。與miR-NC組相比,miR-433-3p過表達(dá)能顯著抑制MAPK8的蛋白表達(dá)水平(P<0.001,圖4C)。

注:A:ELISA檢測miR-433-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)下的H9c2細(xì)胞內(nèi)LDH釋放量的影響;B:MTT檢測miR-433-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)下的H9c2細(xì)胞活性的影響。1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miR-NC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組。與對照組比較,??P<0.01,???P<0.001;與H2O2+miR-NC組比較,##P<0.01,###P<0.001。圖2 miR-433-3p過表達(dá)減輕了H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2活性損傷Note.A,Effect of miR-433-3p overexpression on the release of LDH in H9c2 cells treated with H2O2 was analyzed by ELISA assay.B,Effect of miR-433-3p overexpression on the viability of H9c2 cells treated with H2O2 was examined by MTT assay.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.Compared with control group,??P<0.01,???P<0.001.Compared with H2O2+miR-NC group,##P<0.01,###P<0.001.Figure 2 miR-433-3p overexpression attenuated H2O2-induced activity damage in H9c2 cardiomyocytes

2.5 過表達(dá)MAPK8可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2活性損傷的保護(hù)作用

在H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中過表達(dá)MAPK8,與對照組相比,過表達(dá)MAPK8組中MAPK8蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01,圖5A)。與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNAMAPK8組中的LDH釋放量顯著升高(P<0.01,圖5B)。與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNANC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNAMAPK8組中的細(xì)胞活性顯著下降(P<0.01,圖5C)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)MAPK8可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷的保護(hù)作用。

2.6 過表達(dá)MAPK8可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的抑制作用

與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組相比,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8組H9c2細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase3的表達(dá)水平顯著升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01,圖6)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)MAPK8可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的抑制作用。

注:1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miR-NC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組。與對照組比較,??P<0.01;與H2O2+miR-NC組比較,##P<0.01。圖3 miR-433-3p過表達(dá)抑制了H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡Note.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.Compared with control group,??P<0.01.Compared with H2O2+miR-NC group,##P<0.01.Figure 3 miR-433-3p overexpression inhibited the apoptosis of H9c2 cells treated with H2O2

注:A:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-433-3p和MAPK8之間的關(guān)系;B:qRT-PCR檢測miR-433-3p過表達(dá)對MAPK8蛋白水平的影響;C:Western blot檢測miR-433-3p過表達(dá)對MAPK8 mRNA水平的影響。與miR-NC組比較,???P<0.001。圖4 miR-433-3p負(fù)靶向調(diào)控MAPK8的表達(dá)Note.A,Relationship between miR-433-3p and MAPK8 was deteced by luciferase reporter assay.B,Effect of miR-433-3p overexpression on MAPK8 protein level was examined by qRT-PCR.C,Effect of miR-433-3p overexpression on MAPK8 mRNA level was observed by Western blot.Compared with miR-NC group,???P<0.001.Figure 4 Expression of MAPK8 was negatively regulated by miR-433-3p

注:1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miR-NC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組;5:H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組;6:H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8組。與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNANC組比較,?P<0.05。圖6 過表達(dá)MAPK8可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的抑制作用Note.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.5,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC group.6,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8 group.Compared with H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC group,?P<0.05.Figure 6 Overexpression of MAPK8 reversed the protective effect of miR-433-3p overexpression on apoptosis of H9c2 cells treated with H2O2

注:A:Western blot檢測MAPK8過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率;B:ELISA檢測過表達(dá)MAPK8對H2O2誘導(dǎo)下的H9c2細(xì)胞內(nèi)LDH釋放量的影響;C:MTT檢測過表達(dá)MAPK8對H2O2誘導(dǎo)下的H9c2細(xì)胞活性的影響。1:對照組;2:H2O2組;3:H2O2+miR-NC組;4:H2O2+miR-433-3p mimics組;5:H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組;6:H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8組。與pcDNA-NC組比較,??P<0.01;與H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC組比較,##P<0.01。圖5 過表達(dá)MAPK8可逆轉(zhuǎn)miR-433-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2活性損傷的保護(hù)作用Note.A,Transfection efficiency of MAPK8 overexpression plasmid was detected by western blot analysis.B,Effect of overexpression of MAPK8 on the release of LDH in H9c2 cells treated with H2O2 was analyzed by ELISA assay.C,Effect of overexpression of MAPK8 on the viability of H9c2 cells treated with H2O2 was examined by MTT assay.1,Control group.2,H2O2 group.3,H2O2+miR-NC group.4,H2O2+miR-433-3p mimics group.5,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC group.6,H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-MAPK8 group.Compared with pcDNA-NC group,??P<0.01.Compared with H2O2+miR-433-3p mimics+pcDNA-NC group,##P<0.01.Figure 5 Overexpression of MAPK8 reversed the protective effect of miR-433-3p overexpression on the activity damage of H9c2 cells treated with H2O2

3 討論

研究表明H2O2誘導(dǎo)的多個(gè)基因的表達(dá)變化與心肌細(xì)胞損傷密切相關(guān)[14-16]。但H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷過程中的基因調(diào)控目前還尚不清楚。MicroRNA是一種內(nèi)源性的小編碼RNA,可以通過與靶基因的3’UTR相結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致翻譯抑制或靶基因的降解[17-18]。心血管系統(tǒng)疾病是人類發(fā)病率和死亡率的主要原因且預(yù)后較差,目前由于心肌損傷診斷僅局限在常規(guī)心電圖、血清特異性敏感因子(如心肌酶、心肌肌鈣蛋白等)等有限手段,因此發(fā)現(xiàn)新的心肌損傷生物標(biāo)志物和治療手段顯得尤為重要。一些研究表明,miRNAs不僅在心血管發(fā)育中發(fā)揮重要作用,而且在心臟肥厚、心力衰竭、缺血性心臟病等心血管疾病中也發(fā)揮重要作用[19-22]。MiR-433-3p通常作為抑癌基因在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著不同功能[12,23-24]。據(jù)報(bào)道,miR-433-3p在胃癌[25]、非酒精性脂肪肝炎患者內(nèi)臟脂肪組織[26]和乙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)[27]。此外,miR-433能夠負(fù)靶向調(diào)節(jié)宮頸癌HeLa細(xì)胞中負(fù)責(zé)5-氟尿嘧啶敏感性的胸苷酸合成酶[28]。在心肌中miR-433-3p通過靶向調(diào)節(jié)MAPK8從而影響心肌纖維化的過程[13]。然而,miR-433-3p在心血管疾病中的研究尚未有過相關(guān)報(bào)道。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在H2O2處理心肌細(xì)胞24 h后,細(xì)胞活性呈劑量依賴性的下降。且相比較對照組,miR-433-3p的表達(dá)水平在H2O2處理的心肌細(xì)胞H9c2中顯著下降。預(yù)示了miR-433-3p可能參與H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過程。但miR-433-3p在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的具體作用和機(jī)制還有待研究。

心肌缺血后,心肌細(xì)胞膜外出現(xiàn)大量損傷標(biāo)志物的外漏。其中乳酸脫氫酶(LDH)被認(rèn)為是最能反映出心肌損傷程度的重要分子,通過LDH水平的檢測可以有效反映出心肌損傷的程度[29]。此外,由于H2O2被廣泛用于誘導(dǎo)不同細(xì)胞類型的凋亡反應(yīng),而心肌細(xì)胞H9c2也常被用于研究心肌細(xì)胞凋亡[30]。也有相關(guān)研究顯示氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡與心血管疾病密切相關(guān)。例如,miR-1會影響H9c2心肌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激和抗凋亡能力[31]。因此我們繼續(xù)探討了miR-433-3p對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的作用。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)H2O2能顯著增強(qiáng)H9c2細(xì)胞中的LDH的水平,并誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平的升高和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平的下降進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而miR-433-3p過表達(dá)可以抑制由H2O2誘導(dǎo)的LDH水平上升和細(xì)胞凋亡,有效改善心肌細(xì)胞H9c2的損傷。

有絲分裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)是一類在多種細(xì)胞中扮演著重要調(diào)控作用的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。它在影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡和炎癥等病理過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[32-33]。在心肌損傷中,miR-190可以通過調(diào)節(jié)MAPK8/ERK信號通路保護(hù)心肌細(xì)胞H9c2免受H2O2誘導(dǎo)的凋亡[34]。此外,miR-433-3p可以通過靶向調(diào)節(jié)MAPK8影響心肌纖維化的進(jìn)程[13]。因此,我們推測miR-433-3p可能通過靶向MAPK8影響心肌細(xì)胞的損傷和凋亡。在本研究,我們發(fā)現(xiàn)miR-433-3p可以負(fù)靶向調(diào)控MAPK8。過表達(dá)MAPK8可以逆轉(zhuǎn)miR-433-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性損傷和凋亡的保護(hù)作用?？傊?在H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活性損傷和凋亡中miR-433-3p可以通過靶向調(diào)控MAPK8發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述,miR-433-3p在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中低表達(dá),并能通過直接靶向MAPK8減輕由H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。這一研究成果將有助于闡明治療缺血性心肌損傷的信靶點(diǎn)。