李清平，陳曉藝，譚安薔，羅宇東，龐宇舟，秦超燕

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種發(fā)生在滑膜關(guān)節(jié)及其他器官系統(tǒng)的慢性全身性疾病，表現(xiàn)為滑膜炎持久反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，嚴(yán)重危害人類健康，致殘率高，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致患者喪失生活、工作能力，甚至死亡［1］。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)，目前尚缺乏特效的治療藥物。廣西名中醫(yī)龐宇舟教授運(yùn)用古代經(jīng)方“蠲痹湯”治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎取得滿意療效［2-5］，為方便臨床應(yīng)用及患者攜帶，本課題組擬將其研發(fā)為蠲痹顆粒。本實(shí)驗(yàn)中采用正交試驗(yàn)對(duì)蠲痹顆粒的最佳水提工藝進(jìn)行篩選，為蠲痹顆粒的提取工藝研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器廠）；SQP型電子天平［塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；KQ5200型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：760706；純度≥99.0%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙醇、甲醇等試劑均為分析醇。

2 方法與結(jié)果

2.1 因素水平設(shè)計(jì) 選取對(duì)水提工藝影響較大的加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)作為考察因素，選用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.2 樣品的制備 按處方比例稱取羌活、獨(dú)活、桂心等藥材42.9 g，共9份，按表2正交試驗(yàn)方案安排進(jìn)行提取，合并各提取液，過(guò)濾，濃縮，轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿中置水浴鍋上蒸干，再放入烘箱中80℃干燥，干浸膏研細(xì)儲(chǔ)藏備用。

2.3 總黃酮的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加乙醇溶解制備成每毫升含0.051 7 mg蘆丁的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取干浸膏細(xì)粉3 g，置索氏提取器中，加氯仿加熱回流提取至無(wú)色，棄去氯仿液；藥渣揮去氯仿，加甲醇，提取至無(wú)色，過(guò)濾；提取液蒸干，加乙醇溶解并定容至50 ml容量瓶中，搖勻，即得供試品儲(chǔ)備液。精密量取供試品儲(chǔ)備液5 ml，加水稀釋至25 ml，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1.0 ml，置25 ml容量瓶中，加蒸餾水5.0 ml搖勻，加5%NaNO21.0 ml搖勻，放置6 min，加10%Al（NO3）31.0 ml搖勻，放置6 min，加4%NaOH 10.0 ml，加蒸餾水定容至刻度，搖勻后放置15 min，備用。

將供試品溶液、對(duì)照品溶液顯色處理后，在400～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液的最大吸收峰同在510 nm處，沒(méi)有其他成分的干擾，由此可以選定測(cè)定波長(zhǎng)為510 nm。

2.3.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml，分別置于25 ml容量瓶中，根據(jù)顯色測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），蘆丁濃度（X，mg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=11.877X+0.000 6（r2=0.999 8）。結(jié)果表明蘆丁濃度在0.010 38～0.083 04 mg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取6份蘆丁對(duì)照品溶液2.0 ml，分別置于25 ml量瓶中，顯色，測(cè)定吸光度。結(jié)果6份樣品的吸光度RSD為0.38%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在0 min、5 min、10 min、20 min、40 min、60 min進(jìn)行顯色、測(cè)定。結(jié)果供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD為0.64%（n=6）。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批浸膏（正交試驗(yàn)3號(hào)），按“2.3.2”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，顯色，測(cè)定吸光度。結(jié)果6份供試品溶液吸光度的RSD為1.76%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的浸膏6份，按照供試品溶液方法制備，每份精密吸取1.5 ml，置于25 ml容量瓶中，再分別精密加入相同量蘆丁對(duì)照品溶液，最后加甲醇至6 ml，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定總黃酮的含量，根據(jù)所測(cè)得的相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，6份溶液加樣回收率為97.7%～102.0%，平均加樣回收率為100.23%（RSD<2.0%），符合含量測(cè)定要求。

2.3.9 總黃酮含量測(cè)定 取“2.3.2”項(xiàng)下方法制備的1~9號(hào)供試品溶液，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算出樣品中總黃酮的含量。以總黃酮含量和浸膏得率作為提取工藝的主要考察指標(biāo)，以二者加權(quán)綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)。浸膏得率（%）=浸膏重量/樣品重量×100%。綜合評(píng)分=（浸膏得率/浸膏得率最大值×0.5+總黃酮含量/總黃酮含量最大值×0.5）×100。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)方案安排及結(jié)果

表2中極差（R）顯示，各因素對(duì)考察指標(biāo)影響順序?yàn)镃>B>A，即煎煮次數(shù)>提取時(shí)間>加水量。直觀分析表明，A1>A3>A2、B2>B3>B1、C3>C2>C1，表3方差分析結(jié)果顯示，在所設(shè)計(jì)的因素范圍內(nèi)，因素B（煎煮時(shí)間）和因素C（煎煮次數(shù)）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響，而因素A（加水量）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果則無(wú)顯著性影響，與直觀分析結(jié)果一致。因此，確定最佳組合為A1B2C3，即加8倍量水煎煮3次，每次1.5 h。

表3 方差分析結(jié)果

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，確保提取工藝合理可行，按上述優(yōu)選出的最佳水提工藝（A1B2C3）重復(fù)安排3批實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證結(jié)果表明，按篩選出的最佳水提工藝制備蠲痹顆粒，所得到的干膏得率、總黃酮含量都接近正交試驗(yàn)中的最大值，RSD值均小于2.0%，表明此工藝穩(wěn)定，具有良好的可操作性和重現(xiàn)性。

3 討 論

“蠲痹湯”出自清代程鐘齡的《醫(yī)學(xué)心悟》，為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典名方，由羌活、獨(dú)活、桂心、秦艽、當(dāng)歸、川芎、甘草（炙）、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香等11味藥材組成。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，該方對(duì)改善由活動(dòng)性RA引起的身體煩痛、項(xiàng)背拘急、手足冷痹、腰膝沉重、舉動(dòng)艱難等臨床癥狀、體征及降低急性期反應(yīng)物指標(biāo)方面，療效確切［6-9］。根據(jù)國(guó)家藥品注冊(cè)法規(guī)要求，本課題組擬將其開(kāi)發(fā)成古代經(jīng)典名方類新藥，由于原方臨床使用為湯劑，因此本課題組在選擇提取工藝時(shí)優(yōu)先考慮水提工藝。

本方由多味中藥組成，成分復(fù)雜，選取某個(gè)單一成分作為檢測(cè)指標(biāo)，都不能全面評(píng)價(jià)提取工藝的適用性和可靠性。黃酮類化合物廣泛存在于大自然中，具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛等多方面的藥理活性［10］，故課題組選取簇群藥效活性成分——黃酮類化學(xué)成分為檢測(cè)指標(biāo)，以總黃酮的含量和浸膏得率的加權(quán)綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)評(píng)價(jià)提取工藝具有實(shí)際意義。本試驗(yàn)優(yōu)選出蠲痹顆粒最佳水提工藝條件為：加水8倍量煎煮3次，每次1.5 h。驗(yàn)證結(jié)論也表明此工藝穩(wěn)定，具有良好的重現(xiàn)性和可操作性，可為實(shí)際生產(chǎn)提供參考依據(jù)。