郭文濤,加洛,馮建萍，宋成璽，吳樹(shù)聲，陶元清，栗冬梅

(1.青海省地方病預(yù)防控制所，西寧 810021；2.青海省玉樹(shù)藏族自治州疫病預(yù)防控制中心，玉樹(shù) 815000；3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206)

立克次體(Rickettsias)為原核細(xì)胞型、革蘭染色陰性的專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌。分類學(xué)屬于變形綱立克次體目(Rickettsiales)，下屬的立克次體科包括立克次體屬(Rickettsia)、恙蟲(chóng)病東方體屬(Orientiatsutsugamushi)、埃立克體屬(Ehrlichiea)。其中立克次體屬又分為斑疹傷寒群、斑點(diǎn)熱群。自然界已發(fā)現(xiàn)有20余種對(duì)人類致病[1]。人類通過(guò)被感染立克次體的媒介昆蟲(chóng)(蚤、蜱、螨等)叮咬或接觸其糞便而發(fā)病[2]。近年來(lái)，世界范圍內(nèi)新發(fā)及再發(fā)立克次體病逐年上升，該病已成為世界關(guān)注的疾病[3]，在我國(guó)分布十分廣泛[4]。青海省染疫蚤在歷史資料中未檢索到立克次體相關(guān)研究的報(bào)道。僅對(duì)3種蜱(森林革蜱、草原革蜱、青海血蜱)的立克次體、無(wú)形體、巴貝斯蟲(chóng)流行做了細(xì)菌、原蟲(chóng)流行病學(xué)本底調(diào)查[5]。此次用qPCR方法快速靈敏檢測(cè)蚤類中攜帶的立克次體。現(xiàn)將結(jié)果分析如下：

1 材料與方法

1.1 樣本采集地

2018年7月在興?？h河卡鎮(zhèn)白龍村(北緯 35°11′～35°68′東經(jīng)99.96o41′～99.97°13′)和貴南縣森多鎮(zhèn)卡加村(北緯 35°77′～35°78′東經(jīng)101.11°53′～100.11°55′)采集。

1.2 樣本采集方法

捕獲喜馬拉雅旱獺4只(興海3只、貴南1只)，用槍手殺蟲(chóng)氣霧劑(農(nóng)藥登記證號(hào)：WP20080198)噴殺體表寄生蚤5～10min，用檢蚤鑷采集體表蚤分裝于含75%酒精瓶離心管中帶回實(shí)驗(yàn)室，體視顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類鑒定，記錄樣品信息，將分類后的蚤樣品放回管中保存于-20℃冰箱中。

1.3 主要儀器與試劑

1.3.1儀器設(shè)備 伯樂(lè)(BioRad)CFX96熒光定量PCR儀、臺(tái)式低溫離心機(jī)Eppendorf centrifuge 5804R、振蕩型恒溫金屬浴 BIOER MB-102、電泳儀EPS301/HE33、熒光化學(xué)發(fā)光凝膠圖像分析GEL DOC XR+，Nikon ECLIPSE 80i體視顯微鏡。

1.3.2主要試劑 HR qPCR Master Mix(上海輝瑞生物科技有限公司)；TransTaq -T PCR Easy Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；dNTPs、pfuMasterMiX(北京天根科技有限公司)；血液和組織核酸提取試劑盒Quick-Start Protocol DNeasy blood and tissue Kit、1000bp DNA Ladder Marker(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)；核酸染料(北京普博欣生物科技有限公司)。

1.3.3莫氏立克次體引物序列mo-pr47F(5′-TGTTGATGGTGCAGGATTTGA - 3′)、mo-pr110R(5′-CGAATTTGTAGGGACAGGAAGA- 3′)、mo-T(5′-FAMCAAACTGGCGCTGGTGT-MGB- 3′)由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 蚤樣品全基因組DNA的提取

用眼科鑷將浸于75%酒精中的蚤取出，置于體視顯微鏡下，用解剖針和手術(shù)刀柄將蚤胸腹連接處輕輕切開(kāi)，將全部蚤體組織置于1.5mL離心管中，室溫放置5～6h，待乙醇全部揮發(fā)，用核酸提取試劑盒按手工提取蚤核酸步驟提取單個(gè)蚤樣品的總DNA。

2.2 反應(yīng)體系

用10μL qPCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶和dNTP混合液HR qPCRMasterMix，探針0.8μL(終濃度200nmol/L)， 正、 反向引物各0.8μL(終濃度為400nmol/L)，DNA模板3μL，最后用dd H2O補(bǔ)齊反應(yīng)體系20μL。反應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及空白對(duì)照。

2.3 擴(kuò)增程序

應(yīng)用伯樂(lè)(BioRad，美國(guó)) CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。94℃ 預(yù)變性5min 1個(gè)循環(huán)；94℃變性 15s，60℃退火 45s。40個(gè)循環(huán)。

3 結(jié)果

3.1熒光化學(xué)發(fā)光凝膠圖像分析，在熒光化學(xué)發(fā)光凝膠圖像分析儀下觀察，目標(biāo)條帶的堿基長(zhǎng)度為190bp，出現(xiàn)該長(zhǎng)度條帶者確定為立克次體陽(yáng)性(見(jiàn)圖)。

圖1 M表示marker對(duì)照,DNA Marker 100bp；泳道cd27表示立克次體陽(yáng)性，N表示陰性對(duì)照

3.2以陽(yáng)性對(duì)照Cq值≤35、陰性對(duì)照Cq值為N/A或≥35，空白對(duì)照Cq值為N/A作為判斷依據(jù)，經(jīng)檢測(cè)出現(xiàn)1個(gè)立克次體陽(yáng)性樣本(斧形蓋蚤callopsylladolabris), 陽(yáng)性率為1.43%。

4 討論

立克次體大多是人獸共患病自然疫源性的病原體，在自然界傳播媒介以及嚙齒動(dòng)物宿主之間維持持久循環(huán)[6]。人類因被節(jié)肢動(dòng)物叮咬而感染發(fā)病。節(jié)肢動(dòng)物在媒介生物性疾病的傳播過(guò)程中起著重要作用，是流行病學(xué)研究中不可忽視的一環(huán)。而蚤類又是重要的醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng),不僅叮刺吸血、侵?jǐn)_人畜引發(fā)過(guò)敏性皮炎、貧血，還傳播多種病原體,尤其是鼠疫桿菌和立克次體,導(dǎo)致鼠疫、鼠源型斑疹傷寒等疾病流行,嚴(yán)重危害人畜健康。此次研究結(jié)果顯示，70匹寄生蚤中有1個(gè)樣本為立克次體陽(yáng)性，首次發(fā)現(xiàn)青海染疫蚤攜帶立克次體。提示蚤類潛在攜帶立克次體病原，應(yīng)加強(qiáng)立克次體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，為防控工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。