吳旭，左揚(yáng)松，濮娟，潘艷，祝麗晶，侯盼飛

（南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬漣水人民醫(yī)院，江蘇 漣水 223400）

0 引言

肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居我國惡性腫瘤之首，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2025年，我國肺癌患者總數(shù)將超過100萬，成為世界第一肺癌大國[1]。放射治療是治療肺癌的有效手段之一，然而機(jī)體的免疫環(huán)境復(fù)雜，且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段受到多種因素的影響，了解放療對肺癌免疫細(xì)胞的影響對指導(dǎo)肺癌治療的意義重大。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry, FCM）測定非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）外周血中輔助性T細(xì)胞17(T helper cells 17, Th17)占CD4+T 細(xì)胞百分比，統(tǒng)計(jì)分析放療過程中Th17的變化，為肺癌放療聯(lián)合免疫治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)，為肺癌患者提供更精準(zhǔn)的個體化治療方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2019年8月收治于我院的20例非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）作為研究對象，年齡60-80（70.41±6.85）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理證實(shí)NSCLC；②首次確診；③開始采集標(biāo)本后1月內(nèi)只接受單純放療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于慢性疾病的急性加重期；②合并自身免疫系統(tǒng)疾病以及應(yīng)用免疫抑制劑等藥物。選取我院職工查體健康者30例作為對照組，年齡60-80（68.51±7.39）歲。兩組在性別和年齡方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 血樣采集

肺癌組分別于放療前、放療期間（每隔6次放療）清晨空腹抽取外周靜脈血2mL（肝素抗凝），對照組采集空腹靜脈血2mL（肝素抗凝）。

1.3 放療方法

運(yùn)用直線加速器（Varian 23-Ex，美國）對入選患者均采用6MV X 線 IMRT 外照射，常規(guī)分割 2.0Gy/f，總劑量 DT 60Gy/30f。

1.4 檢測方法

按照試劑盒說明書(Becton, Dickinson and Company，美國)處理標(biāo)本。分別取肝素抗凝血100μL加入已標(biāo)記好的流式管，用RPMI 16401：1 等體積稀釋, 加入2μLBD LEUKO ACTVTN GolgiPlug (37℃迅速解凍)，震蕩混勻后置于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5h。加入20μL CD8 PerCP-Cy5.5和5μL CD3 APC，震蕩混勻后室溫避光孵育15min；加入100μL Fix&Perm中的Reagent A，室溫避光孵育15min，加入3mL PBS1200rpm離心5min，棄去上清，重懸后加入100μL Fix&Perm中的Reagent B后加入20μL的HU IL-17A PE，室溫避光孵育15min，加入3mL PBS，1200rpm離心5min，棄去上清，500μLPBS重懸，采用流式細(xì)胞儀（Navios，美國）檢測Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 與健康對照組相比，肺癌組外周血Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比（0.92±0.49）%顯著低于健康對照組（2.36±1.14）%（P＜0.05）, 見表1。

表1 肺癌組與健康組Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比的比較(±s，%)

表1 肺癌組與健康組Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比的比較(±s，%)

分組 Th17肺癌組 0.92±0.49對照組 2.36±1.14 t 24.42 P 0.00

2.2 肺癌患者放療期間各階段外周血Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比自放療后顯著下降，與放療前相比具有顯著性差異(P＜0.05)，見表2。圖1顯示某一肺癌患者放療期間運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測外周血中Th17的分析圖。

表2 放療各階段Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比的比較(±s，%)

表2 放療各階段Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比的比較(±s，%)

注：*與放療前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05.

分組 Th17放療前 1.28±0.42放療第6次 1.03±0.35*放療第12次 0.59±0.34*放療第18次 0.56±0.35*放療第24次 0.42±0.27*放療第30次 0.32±0.29*F 24.42 P 0.00

圖1 某肺癌患者放療期間外周血中Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞比例

3 討論

CD4+T 細(xì)胞是效應(yīng) T 細(xì)胞的重要成分，根據(jù)效應(yīng)細(xì)胞的生物學(xué)功能特征，將其分為Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Treg）和Th17。Th17首次由Harrington等[2]于2005年首次發(fā)現(xiàn)，高水平表達(dá) IL-23 受體(IL-23R)、IL-1 受體及 IL-18 受體，它的特異性轉(zhuǎn)錄因子是視磺醛酸相關(guān)的孤兒核受體 (ROR-γt)[3]。Th17通過分泌 IL-17、IL-21、IL-22、IL-23等多種細(xì)胞因子參與感染性、自身免疫性等疾病，近年來，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用也成為研究的熱點(diǎn)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組外周血Th17占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比低于健康對照組，這與Horlock[4]等在乳腺癌中的研究結(jié)果是一致的。Th17 可依靠細(xì)胞因子從外周血募集并活化中性粒細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子，從而將細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤至腫瘤組織，進(jìn)而抑制腫瘤的生長[5]。然而，也有研究認(rèn)為在原發(fā)性肝癌、胃癌中，Th17的表達(dá)是增加的，且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 TNM 分期、預(yù)后不良成正相關(guān)。Th17在腫瘤患者升高的原因可能為：腫瘤細(xì)胞高表達(dá)IL-6、IL-8等有利于Thl7分化和擴(kuò)增的細(xì)胞因子及趨化因子等。Th17數(shù)量的增加，引起效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17的分泌增加，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，促進(jìn)新生血管形成；另外，Thl7也可通過NF-κB/ZEB1信號通路加速腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6-8]。Th17在不同的腫瘤中表現(xiàn)出的作用形式不同，考慮與腫瘤類型的差異有關(guān)。Th17與腫瘤之間的關(guān)系復(fù)雜，促進(jìn)或抑制腫瘤的過程及機(jī)制尚需進(jìn)一步的探討，如果明確二者的關(guān)系，將有利于發(fā)現(xiàn)更有效的腫瘤免疫治療方法。

肺癌早期診斷較為困難，確診時只有15%的患者能夠手術(shù)治療，對于無法手術(shù)的患者，放療是主要的治療措施[9]。放療是利用放射線治療惡性腫瘤的一種主要手段之一，在臨床治療腫瘤中異常重要。放療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時也會引起人體免疫細(xì)胞的改變，放療能夠增加部分免疫細(xì)胞的浸潤，增強(qiáng)或抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫功能[10]。我們的研究結(jié)果顯示，肺癌放療過程中，Th17于放療早期既開始顯著下降，說明Th17對于放療非常敏感，但放療期間下降不明顯，不排除放療期間急性肺損傷[11,12]所致，具體的機(jī)制尚不明確。在放療過程中監(jiān)測Th17的動態(tài)演變并適時聯(lián)合免疫干預(yù)，能充分發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能，殺滅腫瘤細(xì)胞，改善患者的預(yù)后。Th17 聯(lián)合放療等治療手段可能成為治療腫瘤的免疫療法的新途徑。