史翔宇 龍翔宇 方永軍 陽(yáng)江華 肖小虎 秦云霞

摘 ?要：根瘤素26-like內(nèi)在蛋白（nodulin 26-like intrinsic proteins， NIPs）是水通道蛋白（aquaporin protein， AQP）中一個(gè)植物特有的亞類(lèi)，主要定位在質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)不帶電荷的類(lèi)金屬溶質(zhì)如硼、甘油、尿素、硅、砷、H2O2、NH3等，在植物營(yíng)養(yǎng)獲取或脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究以擬南芥NIPs序列為參照，利用多種生物信息學(xué)軟件，對(duì)橡膠樹(shù)7個(gè)HbNIPs的基因結(jié)構(gòu)、蛋白理化性質(zhì)、聚類(lèi)分析、組織表達(dá)及割膠處理的應(yīng)答進(jìn)行綜合分析。根據(jù)分析結(jié)果可以初步推斷：7個(gè)HbNIPs應(yīng)是有功能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們不但具有AQP典型的跨膜結(jié)構(gòu)域（4～6個(gè)），保守的NPA基序和關(guān)鍵的ar/R篩選氨基酸，而且從聚類(lèi)的結(jié)果可以推斷它們具有轉(zhuǎn)運(yùn)硼酸、尿素和乳酸的功能。另外，從其啟動(dòng)子調(diào)控元件、表達(dá)分析和翻譯后修飾分析可知，它們的活性及表達(dá)具有受發(fā)育階段、多種激素和磷酸化修飾的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控。該初步結(jié)果有助于進(jìn)一步研究橡膠樹(shù)NIP家族基因的功能及其在橡膠樹(shù)創(chuàng)新育種中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù);根瘤素26-like內(nèi)在蛋白;水通道蛋白;類(lèi)金屬元素

Abstract： Nodulin 26-like intrinsic proteins （NIPs） are one subclass of plant specific aquaporin protein （AQP）， mainly located at cytoplasm or endoplasmic reticulum， in charge of exchange metalloids such as boron， silicon， arsenic， selenium， glycerol， carbamide， H2O2， NH3 etc.， which are indispensible for plant microelement nutrition and stress responses. In this study， seven NIPs homologues of Arabidopsis were screened out on the rubber tree whole genome level， then bioinformations of their gene structure， protein domains and motifs， promter cis-acting elements and expression characteristics were in-depth analyzed through on-line softwares and PRISM. Totally， the seven HbNIPs were putative functional NIPs， because they owned all or partial typical characteristics of AQPs and clustered together with the homologues， such as typical domains for transmembrane， conservative NPA motifs and key ar/R amino acid for substrate determination. From the phylogenetic analysis results， they were predicated to be possibly involved in metalloids assimilation such as boron or glycerol， or lactate. In addition， from the analyses of cis-acting elements in the promoters， expression profiles and post-translational modifications， it is obvious that the activities would be critically regulated by development stages or hormones or phosphorylation. The primary results would benefit for further study on the function and utilization in rubber trees innovative breeding.

Keywords： Hevea brasiliensis; nodulin 26-like intrinsic proteins; aquaporin protein， AQP; metalloid

水通道蛋白（aquaporin protein， AQP）的重要性已經(jīng)為人們所熟知，它們通過(guò)調(diào)節(jié)水分的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠快速調(diào)節(jié)細(xì)胞體積、滲透壓等，維系著細(xì)胞的生命和整個(gè)植物的水分平衡。它們?nèi)绱酥匾粩噙M(jìn)化為成員眾多，功能多樣的主要內(nèi)在蛋白MIP（major intrinsic protein）大家族。依據(jù)其亞細(xì)胞定位及氨基酸序列的同源性分為4大亞類(lèi)：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins， PIPs），液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic proteins， TIPs），根瘤素26-like內(nèi)在蛋白（NOD26-like Intrinsic Proteins， NIPs）以及小分子堿性?xún)?nèi)在蛋白（small basic intrinsic proteins， SIPs）[1]。

根瘤素26-like內(nèi)在蛋白（NOD26-like Intrinsic Proteins， NIPs）作為水通道蛋白AQP家族的一個(gè)大亞類(lèi)，編碼一類(lèi)鑲嵌式膜蛋白，形成讓特異底物雙向通過(guò)的選擇性運(yùn)輸通道，主要轉(zhuǎn)運(yùn)一些不帶電荷的小分子。與其他AQP蛋白亞類(lèi)相同的是，NIPs同樣以多基因家族的形式廣泛存在于植物細(xì)胞中，家族成員較多;與其他AQP蛋白亞類(lèi)不同的是，NIPs對(duì)水的透過(guò)率低或不透過(guò)水，而是轉(zhuǎn)運(yùn)一些其他非金屬物質(zhì)如硼酸、硅酸、甘油、硒和砷等，還有其他物質(zhì)包括甲酰胺、尿素、甘油以及氣體如氨氣、過(guò)氧化氫H2O2等[2-9]。結(jié)構(gòu)上，NIPs通過(guò)通道孔徑及4個(gè)朝向膜內(nèi)部的氨基酸組成的芳香族氨基酸/精氨酸（aromaticar ginine， ar/R）選擇性過(guò)濾結(jié)構(gòu)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)剡x擇通過(guò)底物的特異性[10-11]。目前已報(bào)道的NIPs擬南芥中有9個(gè)[8]、水稻10個(gè)[12]、玉米5個(gè)[13]、小麥4個(gè)[14]、大豆14個(gè)[15]，其中擬南芥AtNIP5;1參與硼的高效吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，AtNIP6;l是負(fù)責(zé)將硼轉(zhuǎn)運(yùn)到生長(zhǎng)中心后再分配[16-17];AtNIP1;1、AtNIP1;2、AtNIP5;1、AtNIP6;1、AtNIP7;1和OsNIP1;1都能轉(zhuǎn)運(yùn)砷[8-9，18-22];AtNIP1;2轉(zhuǎn)運(yùn)鋁[23];OsNIP2;1轉(zhuǎn)運(yùn)硅[24]等。應(yīng)用方面，過(guò)表達(dá)小麥TaNIP可增強(qiáng)植株耐鹽性[25]，而敲除水稻OsNIP3;1則使水稻因缺硼而生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受損[26]。因此科學(xué)家計(jì)劃培育優(yōu)質(zhì)品種能夠多吸收有益元素硒、硼、硅，不吸收或少吸收有毒砷或重金屬鎘等水稻品種，挖掘NIPs功能對(duì)于優(yōu)質(zhì)品種的分子改良具有重要意義[27]。

天然橡膠主要來(lái)源于巴西橡膠樹(shù)，是一種重要的戰(zhàn)略物資和工業(yè)原料。橡膠樹(shù)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)供給及割膠后脅迫清除的效率關(guān)系著其健康與豐產(chǎn)性。硼是橡膠樹(shù)不可或缺的微量元素，缺硼時(shí)，葉片縮小變形;尤其是橡膠樹(shù)開(kāi)割后，隨著膠乳的排出，整個(gè)排膠面內(nèi)細(xì)胞代謝都被激活，水分、甘油、氮素、氨基酸等多種物質(zhì)在乳管細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)，pH的制衡，H2O2等活性氧的產(chǎn)生與消除效率等都會(huì)影響膠乳再生效率[28-32]，水通道蛋白家族的功能挖掘逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前已報(bào)道的7個(gè)橡膠樹(shù)AQP基因[28-32]，4個(gè)基因?qū)儆赑IP家族，3個(gè)屬于TIP家族，它們?cè)谑艿揭蚁├幚砗螅煌蛟陧g皮部或乳管中轉(zhuǎn)錄水平有比較大的變化[29]，推測(cè)乙烯是通過(guò)影響這些基因的表達(dá)而調(diào)控著木質(zhì)部和韌皮部的水分循環(huán)，增加了排膠總量[33]，而NIP家族基因的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以擬南芥NIPs序列為參照，通過(guò)橡膠樹(shù)全基因組檢索，篩選到7個(gè)可能的NIPs，對(duì)橡膠樹(shù)NIPs的基因結(jié)構(gòu)、蛋白理化性質(zhì)和功能域等進(jìn)行對(duì)比、聚類(lèi)進(jìn)化分析、以及基因組織表達(dá)及割膠處理的應(yīng)答等方面進(jìn)行系統(tǒng)分析，為發(fā)掘橡膠樹(shù)NIP蛋白的功能提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?橡膠樹(shù)NIP基因的篩選與分析

以擬南芥、水稻NIP家族基因序列信息為參考，在橡膠樹(shù)全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，去除冗余序列后，最終獲得7個(gè)可能的NIP基因，它們的ID分別為HbNIP7;1（scaffold0091_20327）、HbNIP4;1（scaffold0103_1585880）、HbNIP1;2（scaffold0050_1992929）、HbNIP1;1（scaffold0123_ 1472792）、HbNIP3;1（scaffold0513_732267）、HbNIP5;1（scaffold0655_509650）和HbNIP6;1（scaffold0946_68795）。比對(duì)NIPs的全長(zhǎng)DNA序列和CDS序列，利用GSDS2.0軟件查詢(xún)7個(gè)HbNIP基因的內(nèi)含子和外顯子構(gòu)成，并進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)解析;利用在線(xiàn)軟件ProtParam tool、ProtComp 9.0（亞細(xì)胞定位）、CDD數(shù)據(jù)庫(kù)、MOTIF、TMHMM Serverv.2.0和SOPMA等軟件分析了HbNIPs的理化特性、亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。采用在線(xiàn)軟件Netphos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）預(yù)測(cè)HbNIPs可能的磷酸化位點(diǎn)。

1.2 ?橡膠樹(shù)、擬南芥和水稻NIP家族成員進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

根據(jù)7個(gè)橡膠樹(shù)NIP家族基因的氨基酸序列和從GenBank數(shù)據(jù)中下載獲得的擬南芥和水稻NIP家族成員的氨基酸序列，利用DNAMAN進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，使用MEGA-X軟件和鄰接法（neighbor-joining，NJ）統(tǒng)計(jì)1000重復(fù)時(shí)，最近似的NIPs家族進(jìn)化樹(shù)。

1.3 ?HbNIPs基因啟動(dòng)子順式元件分析

下載HbNIPs各基因編碼區(qū)上游約1.5 kb的啟動(dòng)子序列，利用在線(xiàn)軟件（PlantCARE）統(tǒng)計(jì)分析各基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的數(shù)量和種類(lèi)[34]。

1.4 ?橡膠樹(shù)7個(gè)NIPs基因的組織及表達(dá)分析

本課題組已建立的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)是以橡膠樹(shù)高產(chǎn)品種‘熱研7-33-97品種為材料，構(gòu)建了不同組織（膠乳、葉片、根、樹(shù)皮、雌雄花、種子、胚芽）、葉片的不同發(fā)育時(shí)期（古銅期、變色期、淡綠期、成熟期）、1.5%乙烯利處理不同時(shí)間（0、3、12、24 h）以及橡膠幼苗高低溫脅迫處理不同時(shí)間（4?℃/45?℃，0、6、12 h）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。各個(gè)基因的表達(dá)以（Reads Per Kilobase per Million mapped reads， RPKM）均一化處理。利用此數(shù)據(jù)庫(kù)信息和PRISM數(shù)據(jù)分析軟件，獲得橡膠樹(shù)各HbNIPs基因的表達(dá)模式。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?HbNIPs的鑒定及其結(jié)構(gòu)特征

為全面了解HbNIPs的生物學(xué)特征，以擬南芥NIPs序列為參照，利用多種生物信息學(xué)軟件（軟件信息見(jiàn)1.1-1.3）對(duì)其進(jìn)行全面分析。從其基因結(jié)構(gòu)可知（圖1）：不同HbNIPs基因間的外顯子長(zhǎng)度相似（除了HbNIP5;1的第一個(gè)外顯子和HbNIP1;2的一個(gè)8氨基酸的小外顯子外），內(nèi)含子長(zhǎng)度差異明顯，比如HbNIP6;1基因全長(zhǎng)達(dá)到3371?bp而HbNIP3;1只有1249?bp。除了HbNIP1;2多添加了一個(gè)8氨基酸的小外顯子及HbNIP5;1被選擇性剪接為3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子外，其他5個(gè)HbNIPs都含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)是：除了HbNIP7;1特異地定位于質(zhì)膜上外，其他6個(gè)HbNIPs既可以定位于質(zhì)膜上，也可以定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上（表1）。HbNIP7;1基因結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位的差異暗示著選擇性剪接在HbNIPs基因家族進(jìn)化中起著重要作用，有可能進(jìn)化出新的功能。7個(gè)HbNIPs的基本生化特征是氨基酸長(zhǎng)度為233～305?aa，相對(duì)分子量大小為24～32 ku，理論等電點(diǎn)pI 5.71～9.34，平均親水系數(shù)范圍是0.346～0.713;脂溶指數(shù)分析表明HbNIPs變動(dòng)范圍為95.22～113.02（表2）。

結(jié)構(gòu)特征（CDD在線(xiàn)軟件）和二級(jí)結(jié)構(gòu)（SOMPA軟件）分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)HbNIPs二級(jí)結(jié)構(gòu)均存在α螺旋，延伸帶，β轉(zhuǎn)角和隨機(jī)扭曲，分布情況也相對(duì)一致，以α螺旋和隨機(jī)扭曲為主，占比超過(guò)74%（表1）。7個(gè)HbNIPs結(jié)構(gòu)域保守，其中有4個(gè)含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1-TM6），HbNIP6;1沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域TM3，HbNIP3;1沒(méi)有TM4，因而這2個(gè)蛋白只有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，HbNIP1;2只有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（不含有包括TM1和TM2）（圖2）。它們都含有2個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域NPA（Asn-Pro-Ala）motif，其中HbNIP5;1和HbNIP6;1中的NPA motif突變成NPS-NPV。（圖2）由于纈氨酸V和丙氨酸A同為不帶電荷的非極性氨基酸，所以NPV不會(huì)改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，而且其芳香族氨基酸/精氨酸所形成的選擇過(guò)濾結(jié)構(gòu)（ar/R selectivity filter）具有植物NIPs保守的FA-AR氨基酸組成，所以底物的特異性也應(yīng)該不會(huì)改變（圖2）。

總之，7個(gè)HbNIPs應(yīng)是有功能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們不但具有AQP典型的跨膜結(jié)構(gòu)域（4～6個(gè)），保守的NPA基序和關(guān)鍵的ar/R篩選氨基酸，而且其蛋白的理化性質(zhì)等多個(gè)參數(shù)與已知擬南芥、水稻的同源NIPs相近，因此推測(cè)它們的功能很可能會(huì)相似（擬南芥、水稻的同源NIPs的參數(shù)略），能夠分別特異地轉(zhuǎn)運(yùn)不同的底物。

2.2 ?橡膠樹(shù)HbNIPs成員的生物學(xué)進(jìn)化

為探尋HbNIPs的進(jìn)化，與擬南芥AtNIPs和水稻OsNIPs一起構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)果顯示HbNIPs與擬南芥AtNIPs的進(jìn)化關(guān)系更為接近，初步表明其進(jìn)化的保守性，如HbNIP1;1-2與AtNIP1;1-2、HbNIP4;1和AtNIP4;1-2、HbNIP5;1與AtNIP5;1、HbNIP6;1與AtNIP6;1、HbNIP7;1與AtNIP7;1等分別聚類(lèi)在相近的進(jìn)化分支上。然而，也有單子葉植物與雙子葉的擬南芥和高大喬木橡膠樹(shù)的成員聚在一起，例如水稻的OsNIP3;1與AtNIP5;1、HbNIP5;1、AtNIP6;1和HbNIP6;1聚在一起，而OsNIP2;1和OsNIP2;2、OsNIP4;1則單獨(dú)聚類(lèi)在不同分支上，這表明部分NIPs功能的保守性和相似性，部分NIPs的功能分化晚于物種間的分化，聚類(lèi)結(jié)果對(duì)于鑒定同源基因的功能具有重要的指導(dǎo)意義。

2.3 ?HbNIPs的調(diào)控特征

已有文獻(xiàn)表明水稻中的NIPs活性受磷酸化修飾調(diào)控。利用軟件Netphos 3.1 Server分析結(jié)果如下，HbNIPs氨基酸序列中存在很多個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)分值大于0.5的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的數(shù)量（表3）。眾多磷酸化位點(diǎn)的存在預(yù)示著磷酸化調(diào)控很可能是調(diào)控HbNIPs活性的重要方式。

2.4 ?HbNIPs啟動(dòng)子元件分析

HbNIPs基因啟動(dòng)子分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：各個(gè)基因啟動(dòng)子中具有應(yīng)答多種逆境和激素的順式調(diào)控元件，數(shù)量差異很大而且各個(gè)基因的具有偏好性（表4）：比如與光感知應(yīng)答有關(guān)的LR（light responsive）元件53個(gè);HbNIP4;1有與無(wú)氧脅迫相關(guān)的ARE（anaerobic induction）元件4個(gè);HbNIP7;1中有4個(gè)CGTCA（甲基茉莉酸應(yīng)答元件）等、與干旱有關(guān)的MBS元件與防御脅迫（defense and stress responsiveness）有關(guān)的TC-rich repeat元件;還有其他激素應(yīng)答元件：TGA（生長(zhǎng)素）、ERE（乙烯利）、P-box或者TATC-box（赤霉素）、ABRE（脫落酸）和TCA（水楊酸）。這些信息暗示HbNIPs的功能參與橡膠樹(shù)逆境脅迫應(yīng)答，其表達(dá)受到多種激素協(xié)同調(diào)控。

2.5 ?HbNIPs基因的組織表達(dá)及隨葉片發(fā)育的表達(dá)特征

HbNIPs在膠乳、樹(shù)葉、根、樹(shù)皮、雌花、雄花和種子等7個(gè)組織中的表達(dá)分析結(jié)果（圖4A）表明：它們組織表達(dá)模式各不相同。HbNIP3;1、HbNIP4;1和HbNIP7;1在7種組織中表達(dá)量都很低幾乎檢測(cè)不到，而HbNIP1;1、HbNIP1;2、HbNIP5;1和HbNIP6;1四個(gè)基因的表達(dá)水平較高些而在各個(gè)組織中各有偏重，其中HbNIP5;1在葉、根、雄花、雌花4個(gè)組織中都是優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因;HbNIP1;2在樹(shù)皮中表達(dá)最高;HbNIP1;1在種子中表達(dá)最高;在膠乳中只有HbNIP1;1、HbNIP1;2、HbNIP3;1和HbNIP6;1有表達(dá)，相比起來(lái)，HbNIP1;2是表達(dá)最高的，其他3個(gè)基因表達(dá)量很低。利用乙烯利增產(chǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析這4個(gè)基因的表達(dá)特征（圖4C），結(jié)果表明，這4個(gè)基因受誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)錄水平變動(dòng)幅度不大，但是HbNIP1;1在乙烯利處理后的12 h內(nèi)，膠乳表達(dá)呈上升趨勢(shì)，而HbNIP6;1呈下降趨勢(shì)，而在處理12 h后，二者的表達(dá)漸近恢復(fù)。

另外，對(duì)4個(gè)在葉片中表達(dá)量高的基因成員HbNIP1;1、HbNIP1;2、HbNIP5;1和HbNIP6;1進(jìn)一步分析了它們隨葉片發(fā)育（4個(gè)時(shí)期—古銅期、變色期、淡綠期和成熟期）的表達(dá)情況，同時(shí)也分析了它們是否受高低溫處理誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明：3個(gè)基因呈現(xiàn)出快速遞增的表達(dá)，HbNIP1;2和HbNIP6;1在淡綠期最高，HbNIP1;1在變色期和淡綠期較高，HbNIP5;1在成熟期表達(dá)最高?？傊?，各個(gè)成員的差異表達(dá)表明其功能的時(shí)空差異性和功能特異性（圖4B）。另外，這4個(gè)基因總體上是受低溫的誘導(dǎo)影響小于高溫處理，在低溫處理12 h后，它們的表達(dá)都比處理前略微下降;而HbNIP5;1和HbNIP6;1隨著高溫處理，表達(dá)量迅速下調(diào)2倍，HbNIP1;2則有增加趨勢(shì)（圖4D）。

3 ?討論

3.1 ?HbNIPs具有植物NIPs典型的組成特征，推斷是橡膠樹(shù)中有功能的NIPs蛋白

HbNIPs具有植物NIPs典型的組成特征，而且聚類(lèi)在一起，推斷其在橡膠樹(shù)中發(fā)揮著相似的功能。本研究在橡膠樹(shù)全基因組水平上檢索出7個(gè)NIPs，通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和聚類(lèi)都與其同源基因相似，比如橡膠樹(shù)的HbNIP5;1和HbNIP6;1中的2個(gè)NPA motif進(jìn)化為NPS-NPV，與擬南芥AtNIP5;1和AtNIP6;1一致，因此推測(cè)二者很可能會(huì)參與硼酸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。在橡膠樹(shù)中各個(gè)組織中表達(dá)分析表明：7個(gè)HbNIPs的組織表達(dá)量都比較低，其中HbNIP1;1、HbNIP1;2、HbNIP5;1與HbNIP6;1四個(gè)基因的表達(dá)水平較高些，它們?cè)诟鱾€(gè)組織中各有偏重而且隨著葉片發(fā)育而改變（圖4B），這與其他AQP的NIPs亞家族成員的基因表達(dá)水平相對(duì)低，而且一些NIPs常常在一些特化的細(xì)胞或器官中表達(dá)是一致的。乳管中的表達(dá)情況：橡膠樹(shù)NIPs在膠乳中表達(dá)水平低（圖4A、C），且它們受乙烯利處理后受誘導(dǎo)變化小，因此推測(cè)橡膠樹(shù)NIPs的主要功能很可能不是負(fù)責(zé)木質(zhì)部和韌皮部的水分運(yùn)輸而是主要轉(zhuǎn)運(yùn)特殊的溶質(zhì)比如硼、乳酸等。例如在樹(shù)皮、雄花和雌花部位表達(dá)量較高的HbNIP1;2，是AtNIP2;1的同源蛋白，很可能其功能是選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸，有利于更好地適應(yīng)低氧環(huán)境[35]。由于橡膠樹(shù)乳管中和莖干內(nèi)無(wú)氧代謝活躍[36]，因此與AtNIP2;1聚在一組的HbNIP1;2很可能也參與乳酸的代謝和利用，這個(gè)與這個(gè)基因的啟動(dòng)子含有ARE無(wú)氧應(yīng)答元件是一致的（表4）。另外，從進(jìn)化分析推斷（圖3），如橡膠樹(shù)HbNIP1;1、HbNIP1;2與擬南芥AtNIP1;2在同一進(jìn)化分支上，推測(cè)其可能參與鋁元素的脅迫過(guò)程[23];橡膠樹(shù)HbNIP7;1和擬南芥AtNIP7;1在同一進(jìn)化分支上，推測(cè)其可能提高砷元素脅迫的耐受性[37-38];橡膠樹(shù)HbNIP5;1、HbNIP6;1與擬南芥AtNIP5;1和AtNIP6;1及水稻OsNIP3;1在同一個(gè)進(jìn)化分支上，推測(cè)其可能參與硼酸的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[39]。硼是花粉管生長(zhǎng)、受精和信號(hào)傳遞等過(guò)程中必不可少的微量元素[40-41]，推測(cè)這2個(gè)基因可能在橡膠樹(shù)花器官內(nèi)硼酸轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用。

3.2 ?HbNIPs可能的調(diào)控方式與利用

已有的文獻(xiàn)表明：AQP的功能受多種調(diào)控方式的影響，包括糖基化修飾、磷酸化修飾等，比如質(zhì)膜上的OsNIP1;1[42]、大豆的GmNOD26[43]等受多種蛋白激酶CDPKs調(diào)控。吳偉等[15]啟動(dòng)子元件分析表明多數(shù)NIPs含有響應(yīng)多種脅迫和激素應(yīng)答元件，推斷它們的功能會(huì)受多種調(diào)控而參與植物脅迫應(yīng)答。我們對(duì)橡膠樹(shù)HbNIPs啟動(dòng)子元件分析中發(fā)現(xiàn)，它們除了包括多種激素應(yīng)答元件外，還具有甲基茉莉酸、無(wú)氧，光應(yīng)答元件等?？傊?，根據(jù)綜合分析，HbNIPs的活性及表達(dá)具有受發(fā)育階段、激素及翻譯后修飾等嚴(yán)謹(jǐn)控制，推測(cè)其主要功能不是或不僅是轉(zhuǎn)運(yùn)水，更重要的是轉(zhuǎn)運(yùn)尿素、甘油、硼等物質(zhì)，通過(guò)調(diào)控參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用或脅迫防御，其分子機(jī)理還需要進(jìn)一步去實(shí)驗(yàn)證實(shí)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步鑒定橡膠樹(shù)NIP家族功能的挖掘和利用奠定基礎(chǔ)。

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